HIV vpr上調(diào)NKG2D的配體和介導(dǎo)NK細胞毒效應(yīng)的研究.pdf

1、背景:病毒蛋白R(virus protein R，vpr)是人免疫缺陷病毒(humanimmunodefifiency virus，HIV)基因組的4個輔助基因之一。vpr基因產(chǎn)生的Vpr蛋白在HIV感染宿主細胞的過程和艾滋病(acquiredimmunodefifiency syndrome，AIDS)的發(fā)病機制中起重要作用。它參與病毒整合前復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運，激活病毒的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)細胞周期的G2/M期停滯，促進感染細胞凋亡。NKG2D

2、是NK細胞表面主要的活化型受體之一，與其配體ULBPs結(jié)合后傳導(dǎo)活化信號，誘導(dǎo)NK細胞毒效應(yīng)以殺傷靶細胞。本文將研究HIV-1 Vpr對ULBPs表達的影響，證實vpr基因是激活NKG2D的配體并介導(dǎo)NK細胞毒效應(yīng)的病毒因素之一。
　　目的:體外細胞實驗觀察轉(zhuǎn)染了HIV vpr基因的jurkat細胞表面的NKG2D配體ULBP1和ULBP2的表達情況，印證本研究室前期觀察的HIV感染者CD4+T淋巴細胞表面的NKG2D配體ULBP

3、1和ULBP2較正常人上升的實驗結(jié)果;細胞毒實驗中以抗體封閉NK細胞表面的NKG2D受體后，觀察其對vpr表達陽性的jurkat細胞殺傷力的變化，探索HIV-1 Vpr可能通過調(diào)節(jié)NKG2D配體的表達，激活NK細胞毒效應(yīng)殺傷CD4+T淋巴細胞的分子機制。本研究將有助于進一步闡明HIV-1的致病機制，為艾滋病的治療尋找新的有效分子靶點打下基礎(chǔ)。
　　方法:目的基因HIV-1 vpr來自BSXCYPYVPRXCTHY質(zhì)粒。送質(zhì)粒DNA

4、測序以鑒定vpr片段的基因系列。將vpr用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至急性T細胞白血病細胞株jurkat細胞，用含1640和胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后，RT-PCR檢測目的基因mRNA水平的表達。流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染了vpr基因、轉(zhuǎn)染了空載體和未轉(zhuǎn)染的jurkat細胞表面ULBP1/ULBP2配體雙陽性表達水平。密度梯度離心法從外周靜脈血中分離單個核細胞(PBMC)，磁珠分選出NK細胞（CD56陽性細胞），臺盼蘭染色計數(shù)活細胞后，以來自健康正常人和

5、HIV-1感染者的NK細胞和NKG2D抗體封閉的NK細胞為效應(yīng)細胞，以轉(zhuǎn)染了vpr基因和未轉(zhuǎn)染vpr和PCD基因的jurkat細胞為靶細胞，效靶比為:9∶1，通過細胞毒實驗比較效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷作用。
　　結(jié)果:DNA測序結(jié)果表明BSXCYPYVPRXCTHY質(zhì)粒攜帶的DNA片段與HIV vpr已知基因序列完全一致;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將vpr基因片段和PCD空載體分別轉(zhuǎn)染至jurkat細胞，RT-PCR檢測到目的基因vpr的表達。

6、流式細胞術(shù)檢測到轉(zhuǎn)染了vpr基因的jurkat細胞表面ULBP1/ULBP2配體雙陽性表達水平較未轉(zhuǎn)染vpr基因的細胞升高。細胞毒實驗表明NKG2D封閉后的NK細胞對jurkat細胞的殺傷力下降;來自HIV感染者的NK細胞對jurkat細胞殺傷力低于來自正常人的NK細胞。
　　結(jié)論:1.轉(zhuǎn)染了HIV vpr基因片段的jurkat細胞表面ULBP1/ULBP2受體雙陽性表達水平較PCD轉(zhuǎn)染組和空白組的表達水平升高，提示HIV-1 V

7、pr能上調(diào)jurkat細胞表面NKG2D配體的表達，通過體外細胞實驗證實了本研究室之前的臨床研究結(jié)果:HIV感染者CD4+T淋巴細胞表面的NKG2D配體ULBP1和ULBP2表達較正常人升高;并排除其他基因產(chǎn)物的影響，進一步表明vpr在其中的關(guān)鍵作用。2.NK細胞表面的NKG2D受體被特異性抗體封閉后，較未封閉NKG2D受體的NK細胞對jurkat細胞殺傷力下降，揭示vpr感染后，NK細胞通過活化性受體NKG2D與配體ULBP-1和UL