NKG2D介導的同種異體NK細胞對人腦膠質瘤細胞殺傷效應的實驗研究.pdf

1、腦膠質瘤，亦稱為神經(jīng)膠質細胞瘤，發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占全部顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的36.26％～60.96％。腦膠質瘤尤其是高級別膠質瘤具有異常增生、浸潤性生長、易復發(fā)、血管異常增生及免疫耐受等生物學特性，這使得膠質瘤雖經(jīng)不斷改進的顯微外科手術切除、放射治療、化學治療等措施的綜合處理，仍易復發(fā)，預后不盡人意。如膠質母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)患者雖經(jīng)過綜合治療后，其中位生存時間仍少于15個月。為此臨床需要

2、尋找治療膠質瘤的新方法。
　　 最近的研究證實，同種異體NK細胞能有效地殺傷原代的鼻咽癌、胃癌、腎癌、腸癌和卵巢癌等腫瘤細胞。NK細胞對靶細胞的殺傷活性與NK細胞表面的受體和靶細胞表面的配體之間的相互作用密切相關。NK細胞表面的殺傷抑制受體與靶細胞表面的HLA-Ⅰ類分子的結合，抑制NK細胞對靶細胞的殺傷，而當靶細胞缺乏HLA-Ⅰ類分子時可激發(fā)NK細胞對靶細胞的殺傷作用。NKG2D(natural killer group2D)是

3、NK細胞表面的主要殺傷活化受體，其配體為MHC-Ⅰ類鏈相關分子(MHC classⅠ chain-related molecule，MIC)A和B及人巨細胞病毒UL16蛋白的結合蛋白(UL16 binding proteins，ULBP)1、2和3等。
　　 本研究關注的是同種異體的NK細胞是否具有殺傷膠質瘤細胞的效應。在體外條件下分離、培養(yǎng)人腦膠質瘤細胞(human glioma cell，HGC)，觀察其生物學特性，檢測其H

4、LA-Ⅰ類分子和NKG2D配體的表達，并在體內(nèi)、外條件下觀察同種異體NK細胞殺傷膠質瘤細胞的可行性及其分子基礎，為進一步認識同種異體NK細胞對膠質瘤細胞的殺傷作用提供實驗和理論基礎。從而為膠質瘤的治療探索新的方法。
　　 第一部分、原代培養(yǎng)HGC的生物學特性研究
　　 目的：原代分離、培養(yǎng)、鑒定HGC，并觀察其生物學特性，為探討同種異體NK細胞對HGC的殺傷效應提供必備的基礎。
　　 方法：術中獲取膠質瘤患者腫瘤

5、組織標本(術后病理診斷為膠質瘤Ⅳ級)，分離、培養(yǎng)得到HGC，并經(jīng)GFAP免疫組織化學鑒定為HGC。鏡下觀察膠質瘤細胞生長特點，并將一定劑量的HGC注入BALB/c裸鼠體內(nèi)，觀察移植HGC成瘤特征。
　　 結果：
　　 1.顯微鏡下觀察腫瘤組織HE染色切片見：核濃染，異形性明顯，可見巨核，核分裂等。判定培養(yǎng)細胞來源的組織為膠質瘤Ⅳ級。
　　 2.體外培養(yǎng)的HGC生長良好，群體倍增時間為23.48hr。傳代后的細胞生

6、長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定，有明顯的對數(shù)生長期。
　　 3.培養(yǎng)的HGC經(jīng)HE染色顯示：細胞呈梭形、星形或不規(guī)則形，突起較小，核大小不一。免疫細胞化學結果顯示：絕大多數(shù)細胞GFAP呈陽性反應。
　　 4.將0.1ml(1×106個)HGC的懸液移植入BALB/c裸鼠體內(nèi)，腫瘤出現(xiàn)時間為(9.17±1.68)d，成瘤率為100％，瘤組織為膠質瘤Ⅳ級。
　　 結論：
　　 1.HGC可以在體外進行培養(yǎng)，細胞倍

7、增時間為23.48hr。
　　 2.膠質瘤細胞可成瘤，腫瘤出現(xiàn)時間約為(9.17±1.68)d。
　　 第二部分 HGC HLA-Ⅰ類分子和NKG2D配體表達的檢測
　　 目的：檢測原代培養(yǎng)的HGC HLA-Ⅰ類分子和NKG2D配體表達情況，為進一步認識同種異體NK細胞對膠質瘤細胞的殺傷作用提供實驗和理論基礎。
　　 方法：采用RT-PCR的方法檢測HGC MICA、MICB、ULBP1、ULBP2及UL

8、BP3在mRNA水平的表達；采用流式細胞技術檢測MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3分子及HLA-Ⅰ類分子的表達；采用Western Blot技術檢測MICA、ULBP2及ULBP3蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1.RT-PCR檢測結果顯示HGC在mRNA水平表達NKG2D的配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3。
　　 2.流式細胞儀檢測結果證實HGC表面表達HLA-Ⅰ

9、類分子及NKG2D的配體MICA、ULBP2和ULBP3，不表達NKG2D的配體MICB及ULBP1。
　　 3.MICA、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ類分子在HGC的表達的陽性百分數(shù)分別為63.26±6.71％、61.23±5.97％、51.47±2.43％和89.67±7.28％。
　　 4.Western blot檢測結果證實膠質瘤細胞表面表達NKG2D的配體MICA、ULBP2和ULBP3分子。
　　

10、 結論：
　　 1.HGC在mRNA水平表達NKG2D的配體ULBP1、ULBP2、ULBP3、MICA和MICB。
　　 2.HGC表面表達MICA、ULBP2及ULBP3分子，不表達MICB和ULBP1分子。
　　 3.HGC表面高表達HLA-Ⅰ類分子。
　　 第三部分、同種異體NK細胞對HGC體外殺傷效應的實驗研究
　　 目的：檢測同種異體NK細胞對HGC的殺傷效應。
　　 方法：

11、采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，并通過MACS純化NK細胞；采用MTT方法檢測同種異體NK細胞對HGC殺傷效應，及不同效靶比時NK細胞對HGC的殺傷活性。
　　 結果：
　　 1.分離、純化的陽性部分中，CD3-CD16+CD56+細胞的純度達91.7％。
　　 2.同種異體NK細胞對HGC具有殺傷活性，且殺傷效應隨著效靶比的升高而增強；效靶比為10:1、20:1、50:1和100:1時，殺傷活性分別為：

12、23.64±1.73％、37.28±3.67％、49.63±4.28％和74.16±6.43％。
　　 結論：
　　 1.同種異體NK細胞對HGC具有殺傷活性。
　　 2.HLA-Ⅰ類分子及MICA、ULBP2及ULBP3分子在NK細胞對HGC的殺傷效應中起重要作用。
　　 第四部分、同種異體NK細胞對HGC裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
　　 目的：觀察同種異體NK細胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)對HGC的

13、殺傷效果，為腦膠質瘤免疫治療提供實驗和理論基礎。
　　 方法：BALB/c裸鼠32只，隨機分為4組：A組：無細胞移植組；B組：HGC移植組；C組：HGC+NK細胞移植治療組；D組：單純NK細胞移植組，每組8只。觀察各組裸鼠成瘤時間、腫瘤體積變化，繪制腫瘤生長曲線、計算成瘤率。成瘤3周后，處死裸鼠，取瘤塊稱重，計算腫瘤生長抑制率，腫瘤組織常規(guī)病理檢查。
　　 結果：
　　 1.A組和D組無腫瘤生長，B組和C組腫瘤出

14、現(xiàn)時間分別為(9.23±1.64)d和(15.26±1.53)d。
　　 2.生長曲線顯示同種異體NK細胞能明顯減緩移植入BALB/c裸鼠體內(nèi)的HGC的生長速度。B組和C組裸鼠的瘤體重量分別為(1.74±0.13)g和(1.26±0.08)g，C組瘤體較B組瘤體明顯減小，腫瘤生長抑制率為27.59％。
　　 3.成瘤組織經(jīng)HE染色鑒定為膠質瘤Ⅳ級，C組瘤體HE染色切片可見較多的壞死腫瘤細胞和NK細胞浸潤。