NKG2D介導(dǎo)的同種異體NK細(xì)胞對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤，亦稱為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占全部顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的36.26％～60.96％。腦膠質(zhì)瘤尤其是高級別膠質(zhì)瘤具有異常增生、浸潤性生長、易復(fù)發(fā)、血管異常增生及免疫耐受等生物學(xué)特性，這使得膠質(zhì)瘤雖經(jīng)不斷改進(jìn)的顯微外科手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療等措施的綜合處理，仍易復(fù)發(fā)，預(yù)后不盡人意。如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GBM)患者雖經(jīng)過綜合治療后，其中位生存時間仍少于15個月。為此臨床需要

2、尋找治療膠質(zhì)瘤的新方法。
　　 最近的研究證實，同種異體NK細(xì)胞能有效地殺傷原代的鼻咽癌、胃癌、腎癌、腸癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性與NK細(xì)胞表面的受體和靶細(xì)胞表面的配體之間的相互作用密切相關(guān)。NK細(xì)胞表面的殺傷抑制受體與靶細(xì)胞表面的HLA-Ⅰ類分子的結(jié)合，抑制NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷，而當(dāng)靶細(xì)胞缺乏HLA-Ⅰ類分子時可激發(fā)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用。NKG2D(natural killer group2D)是

3、NK細(xì)胞表面的主要?dú)罨荏w，其配體為MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)分子(MHC classⅠ chain-related molecule，MIC)A和B及人巨細(xì)胞病毒UL16蛋白的結(jié)合蛋白(UL16 binding proteins，ULBP)1、2和3等。
　　 本研究關(guān)注的是同種異體的NK細(xì)胞是否具有殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效應(yīng)。在體外條件下分離、培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(human glioma cell，HGC)，觀察其生物學(xué)特性，檢測其H

4、LA-Ⅰ類分子和NKG2D配體的表達(dá)，并在體內(nèi)、外條件下觀察同種異體NK細(xì)胞殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可行性及其分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步認(rèn)識同種異體NK細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用提供實驗和理論基礎(chǔ)。從而為膠質(zhì)瘤的治療探索新的方法。
　　 第一部分、原代培養(yǎng)HGC的生物學(xué)特性研究
　　 目的：原代分離、培養(yǎng)、鑒定HGC，并觀察其生物學(xué)特性，為探討同種異體NK細(xì)胞對HGC的殺傷效應(yīng)提供必備的基礎(chǔ)。
　　 方法：術(shù)中獲取膠質(zhì)瘤患者腫瘤

5、組織標(biāo)本(術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)瘤Ⅳ級)，分離、培養(yǎng)得到HGC，并經(jīng)GFAP免疫組織化學(xué)鑒定為HGC。鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長特點(diǎn)，并將一定劑量的HGC注入BALB/c裸鼠體內(nèi)，觀察移植HGC成瘤特征。
　　 結(jié)果：
　　 1.顯微鏡下觀察腫瘤組織HE染色切片見：核濃染，異形性明顯，可見巨核，核分裂等。判定培養(yǎng)細(xì)胞來源的組織為膠質(zhì)瘤Ⅳ級。
　　 2.體外培養(yǎng)的HGC生長良好，群體倍增時間為23.48hr。傳代后的細(xì)胞生

6、長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定，有明顯的對數(shù)生長期。
　　 3.培養(yǎng)的HGC經(jīng)HE染色顯示：細(xì)胞呈梭形、星形或不規(guī)則形，突起較小，核大小不一。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：絕大多數(shù)細(xì)胞GFAP呈陽性反應(yīng)。
　　 4.將0.1ml(1×106個)HGC的懸液移植入BALB/c裸鼠體內(nèi)，腫瘤出現(xiàn)時間為(9.17±1.68)d，成瘤率為100％，瘤組織為膠質(zhì)瘤Ⅳ級。
　　 結(jié)論：
　　 1.HGC可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞倍

7、增時間為23.48hr。
　　 2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞可成瘤，腫瘤出現(xiàn)時間約為(9.17±1.68)d。
　　 第二部分 HGC HLA-Ⅰ類分子和NKG2D配體表達(dá)的檢測
　　 目的：檢測原代培養(yǎng)的HGC HLA-Ⅰ類分子和NKG2D配體表達(dá)情況，為進(jìn)一步認(rèn)識同種異體NK細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用提供實驗和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：采用RT-PCR的方法檢測HGC MICA、MICB、ULBP1、ULBP2及UL

8、BP3在mRNA水平的表達(dá)；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3分子及HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)；采用Western Blot技術(shù)檢測MICA、ULBP2及ULBP3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR檢測結(jié)果顯示HGC在mRNA水平表達(dá)NKG2D的配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果證實HGC表面表達(dá)HLA-Ⅰ

9、類分子及NKG2D的配體MICA、ULBP2和ULBP3，不表達(dá)NKG2D的配體MICB及ULBP1。
　　 3.MICA、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ類分子在HGC的表達(dá)的陽性百分?jǐn)?shù)分別為63.26±6.71％、61.23±5.97％、51.47±2.43％和89.67±7.28％。
　　 4.Western blot檢測結(jié)果證實膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面表達(dá)NKG2D的配體MICA、ULBP2和ULBP3分子。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1.HGC在mRNA水平表達(dá)NKG2D的配體ULBP1、ULBP2、ULBP3、MICA和MICB。
　　 2.HGC表面表達(dá)MICA、ULBP2及ULBP3分子，不表達(dá)MICB和ULBP1分子。
　　 3.HGC表面高表達(dá)HLA-Ⅰ類分子。
　　 第三部分、同種異體NK細(xì)胞對HGC體外殺傷效應(yīng)的實驗研究
　　 目的：檢測同種異體NK細(xì)胞對HGC的殺傷效應(yīng)。
　　 方法：

11、采用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，并通過MACS純化NK細(xì)胞；采用MTT方法檢測同種異體NK細(xì)胞對HGC殺傷效應(yīng)，及不同效靶比時NK細(xì)胞對HGC的殺傷活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.分離、純化的陽性部分中，CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的純度達(dá)91.7％。
　　 2.同種異體NK細(xì)胞對HGC具有殺傷活性，且殺傷效應(yīng)隨著效靶比的升高而增強(qiáng)；效靶比為10:1、20:1、50:1和100:1時，殺傷活性分別為：

12、23.64±1.73％、37.28±3.67％、49.63±4.28％和74.16±6.43％。
　　 結(jié)論：
　　 1.同種異體NK細(xì)胞對HGC具有殺傷活性。
　　 2.HLA-Ⅰ類分子及MICA、ULBP2及ULBP3分子在NK細(xì)胞對HGC的殺傷效應(yīng)中起重要作用。
　　 第四部分、同種異體NK細(xì)胞對HGC裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
　　 目的：觀察同種異體NK細(xì)胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)對HGC的

13、殺傷效果，為腦膠質(zhì)瘤免疫治療提供實驗和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：BALB/c裸鼠32只，隨機(jī)分為4組：A組：無細(xì)胞移植組；B組：HGC移植組；C組：HGC+NK細(xì)胞移植治療組；D組：單純NK細(xì)胞移植組，每組8只。觀察各組裸鼠成瘤時間、腫瘤體積變化，繪制腫瘤生長曲線、計算成瘤率。成瘤3周后，處死裸鼠，取瘤塊稱重，計算腫瘤生長抑制率，腫瘤組織常規(guī)病理檢查。
　　 結(jié)果：
　　 1.A組和D組無腫瘤生長，B組和C組腫瘤出

14、現(xiàn)時間分別為(9.23±1.64)d和(15.26±1.53)d。
　　 2.生長曲線顯示同種異體NK細(xì)胞能明顯減緩移植入BALB/c裸鼠體內(nèi)的HGC的生長速度。B組和C組裸鼠的瘤體重量分別為(1.74±0.13)g和(1.26±0.08)g，C組瘤體較B組瘤體明顯減小，腫瘤生長抑制率為27.59％。
　　 3.成瘤組織經(jīng)HE染色鑒定為膠質(zhì)瘤Ⅳ級，C組瘤體HE染色切片可見較多的壞死腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤。