基于分子識別模式和磁分離的化學(xué)發(fā)光與熒光法特異性檢測金黃色葡萄球菌.pdf

1、化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescence，CL）和熒光法（Fluorescence，F(xiàn)L）都屬于分子發(fā)光分析法。CL不需要激發(fā)光源，因此具有設(shè)備簡單，背景信號低，靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點。FL儀器的激發(fā)光源和檢測器不在一條直線上，所以具有信噪比高、檢測限低等優(yōu)點。CL和FL結(jié)合分子識別試劑偶聯(lián)磁性微?？梢杂行У睾喕疤幚磉^程和消除基質(zhì)干擾，還可以進一步提高檢測靈敏度和準確度，非常適用于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

2、 aureus，S. aureus）的檢測。本文利用分子識別試劑免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）和噬菌體肽（Phage-displayed peptide，PDP）對金黃色葡萄球菌的特異性識別作用，結(jié)合磁分離技術(shù)分別建立了金黃色葡萄球菌的競爭化學(xué)發(fā)光檢測法和夾心熒光檢測法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于SPA與IgG結(jié)合作用，構(gòu)建競爭式 CL，直接檢測金黃色葡萄球菌。SPA可以與IgG的Fc片段結(jié)合。SP

3、A存在于大多數(shù)的金黃色葡萄球菌的表面，而在其它細菌的表面不存在或是存在的量非常少，使得金黃色葡萄球菌與 IgG的結(jié)合具有一定的特異性。表面偶聯(lián)SPA的磁珠與金黃色葡萄球菌兩者共同競爭辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的IgG（HRP-tagged IgG）。磁分離之后，在固相中加入共反應(yīng)試劑魯米諾和過氧化氫，測定化學(xué)發(fā)光信號。實驗結(jié)果表明在最優(yōu)條件下，金黃色葡萄球菌的濃度在1.0×101-1.0×

4、109 cfu mL-1范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限是6.0 cfu mL-1（信噪比為3）。該方法具有快速檢測、特異性好、靈敏度高、價格低廉、易于操作等優(yōu)點，有望應(yīng)用于臨床檢測、藥品安全、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。⑵利用兩種多肽構(gòu)建夾心FL，直接特異性檢測金黃色葡萄球菌。我們選用噬菌體肽作為目標菌的特異性識別試劑，并用異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)修飾的抗菌肽magai

5、nin I（FITC-tagged magainin I）制備高靈敏的熒光探針。同時，利用噬菌體肽偶聯(lián)磁性微粒從樣品中分離、捕獲和富集金黃色葡萄球菌，從而減少基質(zhì)對熒光檢測的干擾并且提高檢測靈敏度。與噬菌體、抗體相比，噬菌體肽和抗菌肽具有性狀穩(wěn)定、價格低廉、易于合成和修飾等優(yōu)點。實驗結(jié)果表明金黃色葡萄球菌的濃度在1.0×101-1.0×105 cfu mL-1范圍內(nèi)與熒光信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限為9.0 cfu mL-1（信噪比為