攜人血栓調(diào)節(jié)蛋白基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：
　　構(gòu)建攜帶人血栓調(diào)節(jié)蛋白(hTM)基因的慢病毒表達(dá)載體(plenti6.3-hTM-IRES-EGFP)，體外轉(zhuǎn)染兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)并觀察其在EPCs中的表達(dá)及對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物功能的影響。
　　方法：
　　從重組質(zhì)粒pcDNA3.1/hTM中提取hTM并采用DNA重組技術(shù)將hTM基因?qū)雙Lenti6.3-MCS-IRES-EGFP慢病毒表達(dá)載體中，篩選出陽(yáng)性克隆與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

2、產(chǎn)生病毒顆粒;采用密度梯度離心法分離兔外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞;將內(nèi)皮祖細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、病毒對(duì)照組及空白對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組與病毒對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染plenti6.3-hTM-IRES-EGFP和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP;空白對(duì)照組內(nèi)皮祖細(xì)胞僅加入PBS作觀察;流式細(xì)胞儀法檢測(cè)plenti6.3-hTM-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染72h后用激光共聚焦顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)情況，利用Q-PCR及Western blo

3、t法檢測(cè)細(xì)胞中mRNA及hTM蛋白的表達(dá);Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光法鑒定EPCs;利用MTT法、transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖及遷移活性。
　　結(jié)果：
　　基因測(cè)序及Western blot法證實(shí)重組慢病毒載體plenti6.3-hTM-IRES-EGFP構(gòu)建成功。plenti6.3-hTM-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染EPCs72h后，綠色熒光蛋白表達(dá)率超過90％，流式細(xì)胞儀測(cè)定hTM陽(yáng)性EPC

4、s達(dá)92.9％，Q-PCR及Western blot顯示轉(zhuǎn)染組EPCs hTM mRNA及蛋白表達(dá)呈明顯陽(yáng)性，轉(zhuǎn)染組hTM mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組、病毒對(duì)照組及空白對(duì)照組EPCs的增殖及遷移活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建plenti6.3-hTM-IRES-EGFP重組慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染兔外周血EPCs后，在體外能高效表達(dá)基因產(chǎn)物且不影響EPCs的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步研究hTM在動(dòng)脈血栓疾病中的作