四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的分步構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　本課題旨在構(gòu)建含有四環(huán)素調(diào)控人 Numb基因過(guò)表達(dá)調(diào)控組份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒載體，以及構(gòu)建含有四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過(guò)表達(dá)反應(yīng)組份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒載體，并測(cè)定它們的滴度，為Numb調(diào)控人干細(xì)胞“干性”的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、采用酶切技術(shù)將 Lenti-egfp-IRES-puro載體酶切后獲得 Lenti-I

2、RES-puro骨架。采用凝膠電泳技術(shù)驗(yàn)證 rtta基因片段。將 rtta基因片段連接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，提取質(zhì)粒通過(guò)酶切及基因測(cè)序驗(yàn)證后，將Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒delta、pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒及濃縮病毒。將病

3、毒稀釋后感染293T細(xì)胞，48小時(shí)后，通過(guò)ELISA方法測(cè)定其滴度。
　　2、使用酶切技術(shù)將 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4載體酶切后獲得Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架。使用RT-PCR技術(shù)從人胚胎干細(xì)胞總RNA中獲得人Numb基因片段，將人Numb基因片段連接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中

4、進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，提取質(zhì)粒通過(guò)酶切及基因測(cè)序驗(yàn)證后，將Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒delta、pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒及濃縮病毒。將病毒稀釋后感染293T細(xì)胞，48小時(shí)后，通過(guò)DAPI細(xì)胞染色方法測(cè)定其滴度。
　　結(jié)果：
　　1、Lenti-egfp-IRES-puro載體經(jīng)酶切行瓊脂糖凝膠電泳后，觀(guān)察到有兩條條帶，顯示Lenti-IRES-

5、puro骨架獲取成功。rtta基因片段行瓊脂糖凝膠電泳后，觀(guān)察到在1kbp附近有條帶，顯示 rtta基因片段獲取成功?？寺〉腖enti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒經(jīng)酶切行瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察到有兩條條帶，經(jīng)基因測(cè)序結(jié)果為100％正確，顯示 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，感染后48小時(shí)收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro

6、病毒濃縮液滴度為:6.5*10^7TU/ml，感染后72小時(shí)收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒濃縮液滴度為:5.7*10^7TU/ml。
　　2、Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4載體經(jīng)酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察到有兩條條帶，顯示Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架獲取成功。采用RT-PCR技術(shù)從人胚胎干細(xì)胞總RNA中獲取人Numb基因片段行瓊脂糖凝膠電泳后，觀(guān)察到在2 kbp處有條

7、帶，顯示人Numb基因片段獲取成功。克隆的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察到有兩條條帶，經(jīng)基因測(cè)序結(jié)果為100%正確，顯示Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，感染后48小時(shí)收集的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb病毒濃縮液滴度為:3.5*10^7TU/ml，感染后72小時(shí)后收集的Lenti-EF1a