內(nèi)源性醛類代謝失調(diào)致認(rèn)知損傷的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　內(nèi)源性醛類（甲醛、核糖）在機(jī)體內(nèi)維持一定的生理濃度且具有重要的生理功能。內(nèi)源性甲醛作為甲基供體，參與體內(nèi)葉酸循環(huán)、DNA甲基化、表觀遺傳學(xué)修飾、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控等多種細(xì)胞生物學(xué)過程。內(nèi)源性核糖參與體內(nèi)能量提供物質(zhì)-三磷酸腺苷（ATP）的合成，同時也是 DNA和 RNA的重要組成部分。當(dāng)體內(nèi)內(nèi)源性甲醛、核糖代謝失調(diào)，會造成機(jī)體認(rèn)知功能損傷。已有實驗結(jié)果顯示，隨著老齡化年齡的增加，體內(nèi)甲醛逐漸升高。阿爾茲海默病病人體

2、內(nèi)甲醛與認(rèn)知損傷呈正相關(guān)。甲醛能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、認(rèn)知功能損傷。然而，關(guān)于低濃度甲醛長時間處理神經(jīng)細(xì)胞是否會導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，形態(tài)改變尚未見文獻(xiàn)報道。眾所周知，II型糖尿病病人體內(nèi)葡萄糖含量增加，但已有實驗結(jié)果顯示II型糖尿病病人體內(nèi)的核糖含量同樣顯著增加，并且核糖與蛋白質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)的速度顯著快于葡萄糖，產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物（AGEs）具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。胰島素可以改善學(xué)習(xí)、認(rèn)知損傷，但胰島素能否能挽回核糖產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物造成的神

3、經(jīng)細(xì)胞毒性、認(rèn)知功能損傷尚不可知。
　　目的：
　　探討低濃度甲醛長時間處理神經(jīng)細(xì)胞是否會出現(xiàn)形態(tài)改變、功能損傷。繼而研究阿爾茲海默病致病機(jī)制并對其早期預(yù)防、診斷、治療提供理論依據(jù)。探討胰島素是否能挽回核糖代謝失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞毒性、認(rèn)知功能損傷及可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　運(yùn)用連續(xù)傳代的方法，建立甲醛導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的慢性損傷模型，全息激光成像系統(tǒng)，觀察細(xì)胞體積、面積、厚度、粗糙度、橢圓度等形態(tài)變化以及貼壁情況。

4、激光共聚焦顯微鏡觀察甲醛處理原代神經(jīng)元后其樹突、軸突數(shù)目、長度、復(fù)雜度的變化。運(yùn)用小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞（N2a）建立核糖細(xì)胞毒性損傷模型，CCK-8檢測細(xì)胞活力，結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞數(shù)目，全息激光成像系統(tǒng)檢測細(xì)胞形態(tài)變化，Western blotting檢測不同處理組細(xì)胞內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物、胰島素受體、胰島素受體磷酸化水平以及 GRP78蛋白表達(dá)變化，細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)AGEs定位以及表達(dá)變化，ThT染色檢測細(xì)胞內(nèi)纖維纏結(jié)變化。高效液相色譜

5、檢測細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的核糖含量。免疫共沉淀檢測細(xì)胞內(nèi)胰島素受體與糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是否有相互作用。采用腹腔注射核糖，建立核糖導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷動物模型。拉力檢測小鼠前肢力量，水迷宮、Y迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，轉(zhuǎn)棒實驗檢測小鼠平衡能力。Western blotting、免疫組化檢測各組織內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物、胰島素受體、磷酸化胰島素受體、組織蛋白酶-D表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　病理濃度甲醛長時間處理神經(jīng)細(xì)胞，會導(dǎo)致細(xì)胞變厚、

6、變圓，貼壁能力減弱。同時使神經(jīng)元突起的一級結(jié)構(gòu)減少，神經(jīng)連接減少。核糖處理細(xì)胞，細(xì)胞活力隨核糖處理的濃度增加顯著的下降，細(xì)胞的的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增加。胰島素通過激活胰島素受體，使胰島素受體磷酸化增加，繼而激活細(xì)胞內(nèi)清除AGEs的途徑，從而挽回核糖處理24h產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞活力增加、細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞內(nèi)AGEs表達(dá)量顯著下降。相同濃度的葡萄糖處理細(xì)胞，細(xì)胞活力與對照組比較無明顯變化，胞內(nèi)AGEs也無變化。長時間注射，小鼠的

7、體重增加，但各處理組小鼠增加的速度低于對照組。在第32天，核糖處理組、核糖加胰島素處理小鼠體重顯著低于對照組。腹腔注射會使小鼠的前肢拉力逐漸下降，核糖處理組小鼠下降的速度高于對照組和其他實驗處理組，并在第20天時與對照組存在顯著差異，但結(jié)束給藥后，各處理組小鼠的前肢拉力恢復(fù)到最初狀態(tài)，核糖處理組小鼠上升最慢。腹腔注射實際對小鼠存在一種損傷，影響小鼠的肌肉能力。各處理組血糖無明顯變化。運(yùn)用水迷宮、Y迷宮檢測各處理組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷

8、宮結(jié)果顯示核糖處理小鼠，小鼠的學(xué)習(xí)能力增加，但隨后的檢測結(jié)果顯示核糖處理組小鼠的空間記憶能力損傷。Y迷宮結(jié)果提示核糖處理組，小鼠的工作記憶與對照組相比有損傷，與核糖加胰島素處理組的記憶能力比存在顯著差異。運(yùn)用轉(zhuǎn)棒實驗排除運(yùn)動的因素的影響。轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示，核糖處理組小鼠的耐力、平衡能力與對照組沒有變化，但與胰島素組、核糖加胰島素處理組存在顯著差異。蛋白免疫印跡檢測了各處理組血清中蛋白以及糖基化終末產(chǎn)物的量，實驗結(jié)果顯示，核糖處理組小鼠血