肺內(nèi)源性-外源性因素致急性肺損傷機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由于肺內(nèi)、外各種病因?qū)е碌囊约毙?、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)的綜合征。從病因上可將ALI/ARDS分為肺內(nèi)因素(如吸人性肺炎)及肺外因素(嚴(yán)重休克、脂肪栓塞)兩類。國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為肺內(nèi)因素性ALl及肺外因素性.ALl的差異可能對(duì)ALl的研究及治療帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。我們采用大腸桿菌氣管注入性肺炎作為肺內(nèi)源性ALl模型，油酸靜脈注射作為肺外源性ALl模型，以此進(jìn)行對(duì)比研究其病理、病理生

2、理、體內(nèi)促炎介質(zhì)、抗炎介質(zhì)及一氧化氮合酶的變化，觀察他們的變化差異，為進(jìn)一步研究治療ALl提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 1.材料及儀器 新西蘭大白兔27只，體重2.5-3.0kg，雄雌不拘，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供；大腸桿菌(25922標(biāo)準(zhǔn)株)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院細(xì)菌室提供；血?dú)夥治鰞x(瑞士AVL OMNI V)，HP便攜式監(jiān)護(hù)儀，Bear 1000 t/es型呼吸機(jī)，電子菌液比濁儀，SUNRIS型酶標(biāo)儀；肌松劑：維庫(kù)溴

3、胺，麻醉劑：20％烏拉坦；TNF、IL-6放免試劑盒，IL-10 ELISA試劑盒，iNOS、eNOS免疫組化試劑盒，即用型SABC試劑盒。 2.細(xì)菌懸液的制備 (1)將大腸桿菌菌種接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，取菌落分裝于無(wú)菌試管中，-20℃冰箱備用。(2)將-20℃冰箱備用的大腸桿菌菌種接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，取菌落混于無(wú)菌生理鹽水中，用電子比濁儀調(diào)整菌液濃度，使菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?/p>

4、(此濃度相當(dāng)于l×108cfu/m1)，取12ml(相當(dāng)于12×108cfu)菌液在37℃水浴中備用。 3.實(shí)驗(yàn)分組 將大白兔隨機(jī)分為四組，Ⅰ組：細(xì)菌注入組n=8，Ⅱ組：油酸靜脈注射組n=8，Ⅲ組：生理鹽水氣管注入組n=6，Ⅳ組：對(duì)照組n=5。 4.動(dòng)物模型制作 4.1大腸桿菌氣管注入模型制作 動(dòng)物稱重后經(jīng)20％烏拉坦(5ml/kg)腹腔麻醉后，將兔仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，分離出氣管，切開(kāi)氣管置入內(nèi)

5、徑4mm氣管插管，以備連接呼吸機(jī)；頸外靜脈置入4F的心導(dǎo)管，建立液體通道并通過(guò)壓力換能器接監(jiān)護(hù)儀，同時(shí)進(jìn)行中心靜脈壓測(cè)定及采取靜脈血標(biāo)本；頸外動(dòng)脈插管并通過(guò)壓力換能器接監(jiān)護(hù)儀進(jìn)行血壓(BP)，心率(HR)，心律監(jiān)測(cè)及采取動(dòng)脈血標(biāo)本。Ⅰ組：將上述備用菌液12ml分為四次，3ml/次，共20min。通過(guò)氣管插管分別采取仰臥位、左側(cè)臥位、右側(cè)臥位、俯臥位四個(gè)體位，注入氣管。每隔1h采動(dòng)脈血?dú)?，至氧合指?shù)(PaO2/FiO2)≤300mmHg時(shí)

6、，表示.ALI模型制作成功，進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)檢測(cè)并終止實(shí)驗(yàn)；Ⅲ組：將預(yù)先37℃水浴的生理鹽水12ml代替Ⅰ組菌液，余操作同Ⅰ組，7 h時(shí)進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)檢測(cè)并終止實(shí)驗(yàn)；Ⅳ組：未進(jìn)行氣管注入物質(zhì)，其余操作同Ⅰ組，7 h時(shí)進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)檢測(cè)并終止實(shí)驗(yàn)。 4.2大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈致急性肺損傷的對(duì)比研究 大白兔稱重后經(jīng)20％烏拉坦(5ml/kg)麻醉后，固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，進(jìn)行氣管、頸外靜脈、頸動(dòng)脈插管，并通過(guò)壓力換能器接HP便攜式監(jiān)

7、護(hù)儀，進(jìn)行有創(chuàng)BP,HR監(jiān)測(cè)。Ⅰ組：將菌液12ml分為四次，3ml/次，共20 min。經(jīng)過(guò)氣管插管分別四個(gè)體位，注入氣管，每隔1h采動(dòng)脈血?dú)猓裂鹾现笖?shù)(PaO2/FiO2)≤300mmHg，表示ALl模型制作成功，進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，留取血標(biāo)本，并終止實(shí)驗(yàn)；Ⅱ組：頸外靜脈緩慢推入油酸(0.08ml/kg)，20 min內(nèi)推完，余操作參照Ⅰ組。Ⅳ組：未進(jìn)行氣管注入物質(zhì)，其余操作同細(xì)菌組，7小時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。 5.指標(biāo)監(jiān)測(cè) 手

8、術(shù)操作及儀器連接結(jié)束后0.5 h檢測(cè)以下各項(xiàng)基礎(chǔ)參數(shù)：收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，中心靜脈壓，動(dòng)脈及混合靜脈血?dú)夥治?，呼吸力學(xué)測(cè)定，取得基礎(chǔ)參數(shù)后給予細(xì)菌(生理鹽水，油酸)，持續(xù)監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)：SBP、DBP，HR、心律；以后每1 h采動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?；?shí)驗(yàn)結(jié)束前進(jìn)行呼吸力學(xué)測(cè)定。(1)呼吸力學(xué)測(cè)定：靜脈推注肌松劑維庫(kù)溴胺0.4mg，抑制兔的自主呼吸，下食道氣囊，將潮氣量增加至15 ml/kg，呼吸頻率降至lO b/min，峰

9、流速降至5 L/min，通過(guò)調(diào)整吸氣末暫停時(shí)間，以保持I：E=1:2，此時(shí)壓力-容積(P-V)曲線類似靜態(tài)P-V曲線，根據(jù)此曲線呼吸機(jī)自動(dòng)給出肺的順應(yīng)性(CL)，氣道峰壓(PIP)。(2)肺氣體交換：從頸動(dòng)脈插管取動(dòng)脈血作血?dú)夥治?，測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)o肺內(nèi)分流(Qs/Qt)的測(cè)算：動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y(cè)出PaO2，PaCO2，SvO2，血紅蛋白(Hb)；從心導(dǎo)管取混合靜脈血，測(cè)定混合靜脈血氧分壓(PvO2)

10、，二氧化碳分壓(PvCO2)和氧飽和度(SvO2)，按下列公式計(jì)算Qs/Qt：Qs/Qt=(CcO2-CaO2)/(CcO2-CvO2)，CcO2為肺泡毛細(xì)血管血氧含量，CaO2為動(dòng)脈血氧含量，CvO2為混合靜脈血氧含量，在吸100％氧時(shí)CcO2=PaO2×0.0031+Hb×1.34×SaO2。 6.標(biāo)本的處理 在預(yù)定時(shí)間放血處死大白兔，將心肺聯(lián)合取出胸腔，從腹側(cè)和背側(cè)觀察大體標(biāo)本的改變，右下葉進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，4m

11、l/次，共3次，灌洗液經(jīng)3層紗布過(guò)濾后計(jì)算回收量，取一滴回收液于顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余標(biāo)本于1200rpm 4℃條件下離心10 min，留取上清液，-70℃冷凍保存，用于蛋白含量及細(xì)胞因子TNF、IL-6、IL-10的測(cè)定。左肺下葉用4％的多聚甲醛灌注固定，置于4％的多聚甲醛浸泡24 h以上，常規(guī)脫水、包埋制成蠟塊，連續(xù)4μm切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化染色。剪下右肺中葉，置于電子天平儀上稱濕重(W)，然后置60℃

12、恒溫箱，48小時(shí)后稱干重(D)，計(jì)算濕重/干重比值(W/D)?；A(chǔ)血清、結(jié)束血清標(biāo)本-70℃冷凍保存，進(jìn)行TNF、IL-6、IL-10的測(cè)定。 7.檢測(cè)方法 7.1 BALF 中蛋白含量：采用雙縮脲法。 7.2 血清及BALF中炎性介質(zhì)：TNF、IL-6采用放射免疫法、IL-10采用ELISA法檢測(cè)。 7.3 病理標(biāo)本：HE染色切片置于400倍光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)，并參照Kendra半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肺泡、肺

13、間質(zhì)白細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡、肺閭質(zhì)水腫進(jìn)行評(píng)分。 7.4 肺組織iNOS、eNOS免疫組化的檢測(cè)：采用鼠抗兔iNOS、eNOS多克隆抗體和SABC染色法、DAB顯色，然后置于400倍光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)，并參照Elia N評(píng)分：結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，利用SPSSl2.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。同組實(shí)驗(yàn)前后數(shù)據(jù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間均值比較采用單因

14、素方差分析q檢驗(yàn)，兩因素之間的相關(guān)分析用bivariate分析，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.氣管內(nèi)直接注入12×108cfu大腸桿菌6h左右，動(dòng)物可出現(xiàn)典型的ALI病理、病理生理變化。 2.給予生理鹽水氣管注入早期也出現(xiàn)一過(guò)性的低氧血癥，但很快恢復(fù)；繼續(xù)觀察至7h，不再出現(xiàn)低氧血癥，也不出現(xiàn)ALI其他病理、病理生理變化。 3.細(xì)菌組大體見(jiàn)兩肺組織充血、水腫，下葉比上葉明顯，呈重力依賴性改變，病

15、理改變以白細(xì)胞浸潤(rùn)為主；油酸組其大體見(jiàn)兩肺組織彌漫充血、水腫，病理改變以肺泡及肺泡間隔水腫為主。細(xì)菌組肺順應(yīng)性下降，肺內(nèi)分流增加，氣道峰壓增加有比油酸組相對(duì)更為嚴(yán)重的趨勢(shì)，可能由于細(xì)菌組局部充血、細(xì)胞浸潤(rùn)所致氣道及肺泡病變較重，而油酸組病變呈現(xiàn)彌漫性充血、水腫有關(guān)。 4.大腸桿菌氣管注入、油酸靜脈注射所致ALI可導(dǎo)致TNF、IL-6升高；TNF與IL-6有著明顯的正相關(guān)，二者共同加重了肺組織損傷。兩組比較細(xì)菌組TNF、IL-6升

16、高更明顯。BALF/血清比值提示大腸桿菌氣管注入致ALI以肺內(nèi)局部炎癥反應(yīng)為主，油酸靜脈注射所致.ALl以全身炎癥反應(yīng)為主。 5.大腸桿菌氣管注入、油酸靜脈注射所致.ALl均可導(dǎo)致IL-10升高；IL-10與TNF呈正相關(guān)，提示二者共同作用介導(dǎo)著炎癥的發(fā)展。大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈所致ALI比較，其IL-10升高更明顯。 6.大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈注射所致ALl，其肺組織iNOS的表達(dá)明顯升高。大腸桿菌氣管注入與油