肺內(nèi)源性-外源性因素致急性肺損傷機制研究.pdf

1、急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由于肺內(nèi)、外各種病因?qū)е碌囊约毙?、進行性、缺氧性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)的綜合征。從病因上可將ALI/ARDS分為肺內(nèi)因素(如吸人性肺炎)及肺外因素(嚴重休克、脂肪栓塞)兩類。國內(nèi)外學者認為肺內(nèi)因素性ALl及肺外因素性.ALl的差異可能對ALl的研究及治療帶來深遠的影響。我們采用大腸桿菌氣管注入性肺炎作為肺內(nèi)源性ALl模型，油酸靜脈注射作為肺外源性ALl模型，以此進行對比研究其病理、病理生

2、理、體內(nèi)促炎介質(zhì)、抗炎介質(zhì)及一氧化氮合酶的變化，觀察他們的變化差異，為進一步研究治療ALl提供實驗及理論依據(jù)。 1.材料及儀器 新西蘭大白兔27只，體重2.5-3.0kg，雄雌不拘，中國醫(yī)科大學實驗動物部提供；大腸桿菌(25922標準株)：中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院細菌室提供；血氣分析儀(瑞士AVL OMNI V)，HP便攜式監(jiān)護儀，Bear 1000 t/es型呼吸機，電子菌液比濁儀，SUNRIS型酶標儀；肌松劑：維庫溴

3、胺，麻醉劑：20％烏拉坦；TNF、IL-6放免試劑盒，IL-10 ELISA試劑盒，iNOS、eNOS免疫組化試劑盒，即用型SABC試劑盒。 2.細菌懸液的制備 (1)將大腸桿菌菌種接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，取菌落分裝于無菌試管中，-20℃冰箱備用。(2)將-20℃冰箱備用的大腸桿菌菌種接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，取菌落混于無菌生理鹽水中，用電子比濁儀調(diào)整菌液濃度，使菌液濃度為0.5麥氏濁度

4、(此濃度相當于l×108cfu/m1)，取12ml(相當于12×108cfu)菌液在37℃水浴中備用。 3.實驗分組 將大白兔隨機分為四組，Ⅰ組：細菌注入組n=8，Ⅱ組：油酸靜脈注射組n=8，Ⅲ組：生理鹽水氣管注入組n=6，Ⅳ組：對照組n=5。 4.動物模型制作 4.1大腸桿菌氣管注入模型制作 動物稱重后經(jīng)20％烏拉坦(5ml/kg)腹腔麻醉后，將兔仰臥位固定在實驗臺上，分離出氣管，切開氣管置入內(nèi)

5、徑4mm氣管插管，以備連接呼吸機；頸外靜脈置入4F的心導管，建立液體通道并通過壓力換能器接監(jiān)護儀，同時進行中心靜脈壓測定及采取靜脈血標本；頸外動脈插管并通過壓力換能器接監(jiān)護儀進行血壓(BP)，心率(HR)，心律監(jiān)測及采取動脈血標本。Ⅰ組：將上述備用菌液12ml分為四次，3ml/次，共20min。通過氣管插管分別采取仰臥位、左側(cè)臥位、右側(cè)臥位、俯臥位四個體位，注入氣管。每隔1h采動脈血氣，至氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)≤300mmHg時

6、，表示.ALI模型制作成功，進行有關(guān)指標檢測并終止實驗；Ⅲ組：將預先37℃水浴的生理鹽水12ml代替Ⅰ組菌液，余操作同Ⅰ組，7 h時進行有關(guān)指標檢測并終止實驗；Ⅳ組：未進行氣管注入物質(zhì)，其余操作同Ⅰ組，7 h時進行有關(guān)指標檢測并終止實驗。 4.2大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈致急性肺損傷的對比研究 大白兔稱重后經(jīng)20％烏拉坦(5ml/kg)麻醉后，固定在實驗臺上，進行氣管、頸外靜脈、頸動脈插管，并通過壓力換能器接HP便攜式監(jiān)

7、護儀，進行有創(chuàng)BP,HR監(jiān)測。Ⅰ組：將菌液12ml分為四次，3ml/次，共20 min。經(jīng)過氣管插管分別四個體位，注入氣管，每隔1h采動脈血氣，至氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)≤300mmHg，表示ALl模型制作成功，進行有關(guān)指標檢測，留取血標本，并終止實驗；Ⅱ組：頸外靜脈緩慢推入油酸(0.08ml/kg)，20 min內(nèi)推完，余操作參照Ⅰ組。Ⅳ組：未進行氣管注入物質(zhì)，其余操作同細菌組，7小時終止實驗。 5.指標監(jiān)測 手

8、術(shù)操作及儀器連接結(jié)束后0.5 h檢測以下各項基礎(chǔ)參數(shù)：收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，中心靜脈壓，動脈及混合靜脈血氣分析，呼吸力學測定，取得基礎(chǔ)參數(shù)后給予細菌(生理鹽水，油酸)，持續(xù)監(jiān)測血流動力學：SBP、DBP，HR、心律；以后每1 h采動脈血進行血氣分析；實驗結(jié)束前進行呼吸力學測定。(1)呼吸力學測定：靜脈推注肌松劑維庫溴胺0.4mg，抑制兔的自主呼吸，下食道氣囊，將潮氣量增加至15 ml/kg，呼吸頻率降至lO b/min，峰

9、流速降至5 L/min，通過調(diào)整吸氣末暫停時間，以保持I：E=1:2，此時壓力-容積(P-V)曲線類似靜態(tài)P-V曲線，根據(jù)此曲線呼吸機自動給出肺的順應性(CL)，氣道峰壓(PIP)。(2)肺氣體交換：從頸動脈插管取動脈血作血氣分析，測定動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)o肺內(nèi)分流(Qs/Qt)的測算：動脈血氣分析測出PaO2，PaCO2，SvO2，血紅蛋白(Hb)；從心導管取混合靜脈血，測定混合靜脈血氧分壓(PvO2)

10、，二氧化碳分壓(PvCO2)和氧飽和度(SvO2)，按下列公式計算Qs/Qt：Qs/Qt=(CcO2-CaO2)/(CcO2-CvO2)，CcO2為肺泡毛細血管血氧含量，CaO2為動脈血氧含量，CvO2為混合靜脈血氧含量，在吸100％氧時CcO2=PaO2×0.0031+Hb×1.34×SaO2。 6.標本的處理 在預定時間放血處死大白兔，將心肺聯(lián)合取出胸腔，從腹側(cè)和背側(cè)觀察大體標本的改變，右下葉進行支氣管肺泡灌洗，4m

11、l/次，共3次，灌洗液經(jīng)3層紗布過濾后計算回收量，取一滴回收液于顯微鏡下進行白細胞計數(shù)，剩余標本于1200rpm 4℃條件下離心10 min，留取上清液，-70℃冷凍保存，用于蛋白含量及細胞因子TNF、IL-6、IL-10的測定。左肺下葉用4％的多聚甲醛灌注固定，置于4％的多聚甲醛浸泡24 h以上，常規(guī)脫水、包埋制成蠟塊，連續(xù)4μm切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化染色。剪下右肺中葉，置于電子天平儀上稱濕重(W)，然后置60℃

12、恒溫箱，48小時后稱干重(D)，計算濕重/干重比值(W/D)?；A(chǔ)血清、結(jié)束血清標本-70℃冷凍保存，進行TNF、IL-6、IL-10的測定。 7.檢測方法 7.1 BALF 中蛋白含量：采用雙縮脲法。 7.2 血清及BALF中炎性介質(zhì)：TNF、IL-6采用放射免疫法、IL-10采用ELISA法檢測。 7.3 病理標本：HE染色切片置于400倍光學顯微鏡下觀測，并參照Kendra半定量評分標準，對肺泡、肺

13、間質(zhì)白細胞浸潤，肺泡、肺閭質(zhì)水腫進行評分。 7.4 肺組織iNOS、eNOS免疫組化的檢測：采用鼠抗兔iNOS、eNOS多克隆抗體和SABC染色法、DAB顯色，然后置于400倍光學顯微鏡下觀測，并參照Elia N評分：結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分。 8.統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用均值±標準差(-x±s)表示，利用SPSSl2.0統(tǒng)計軟件分析。同組實驗前后數(shù)據(jù)的比較采用配對t檢驗，組間均值比較采用單因

14、素方差分析q檢驗，兩因素之間的相關(guān)分析用bivariate分析，p<0.05有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.氣管內(nèi)直接注入12×108cfu大腸桿菌6h左右，動物可出現(xiàn)典型的ALI病理、病理生理變化。 2.給予生理鹽水氣管注入早期也出現(xiàn)一過性的低氧血癥，但很快恢復；繼續(xù)觀察至7h，不再出現(xiàn)低氧血癥，也不出現(xiàn)ALI其他病理、病理生理變化。 3.細菌組大體見兩肺組織充血、水腫，下葉比上葉明顯，呈重力依賴性改變，病

15、理改變以白細胞浸潤為主；油酸組其大體見兩肺組織彌漫充血、水腫，病理改變以肺泡及肺泡間隔水腫為主。細菌組肺順應性下降，肺內(nèi)分流增加，氣道峰壓增加有比油酸組相對更為嚴重的趨勢，可能由于細菌組局部充血、細胞浸潤所致氣道及肺泡病變較重，而油酸組病變呈現(xiàn)彌漫性充血、水腫有關(guān)。 4.大腸桿菌氣管注入、油酸靜脈注射所致ALI可導致TNF、IL-6升高；TNF與IL-6有著明顯的正相關(guān)，二者共同加重了肺組織損傷。兩組比較細菌組TNF、IL-6升

16、高更明顯。BALF/血清比值提示大腸桿菌氣管注入致ALI以肺內(nèi)局部炎癥反應為主，油酸靜脈注射所致.ALl以全身炎癥反應為主。 5.大腸桿菌氣管注入、油酸靜脈注射所致.ALl均可導致IL-10升高；IL-10與TNF呈正相關(guān)，提示二者共同作用介導著炎癥的發(fā)展。大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈所致ALI比較，其IL-10升高更明顯。 6.大腸桿菌氣管注入與油酸靜脈注射所致ALl，其肺組織iNOS的表達明顯升高。大腸桿菌氣管注入與油