基于DNA條形碼的細(xì)小種子類及含靛玉紅類中藥材的鑒定研究.pdf

1、我國藥用動植物資源豐富，2010年版《中國藥典》收錄的中藥多達(dá)600多種。然而由于南北差異和歷史沿革等原因，同名異物的混淆品或代用品極多，嚴(yán)重影響了中藥材的臨床療效和用藥安全，一直是中藥產(chǎn)業(yè)化、國際化的主要挑戰(zhàn)之一。DNA條形碼技術(shù)在解決這一問題上擁有自己獨(dú)特的優(yōu)勢，2010年版《中國藥典》增補(bǔ)本已收錄中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則。本文以《中國藥典》收錄的直徑小于2毫米的細(xì)小種子類中藥材和含靛玉紅類中藥材為研究對象，基于ITS2序

2、列探討中藥材DNA條形碼分子鑒定法在實(shí)際鑒定工作中的操作流程及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，得出以下結(jié)論：
　　（1）本實(shí)驗(yàn)以直徑小于2毫米的車前子、青葙子、天仙子、葶藶子、菟絲子和王不留行6種細(xì)小種子類中藥材及其混偽品為研究對象，共包含28個(gè)物種144份實(shí)驗(yàn)材料。用試劑盒法提取細(xì)小種子類中藥材及其混偽品的144份樣本的總DNA，通過PCR擴(kuò)增其ITS2序列并雙向測序。應(yīng)用CodonCode Aligner v4.25對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，去除

3、低質(zhì)量序列及引物區(qū)獲得ITS2序列。用MEGA6.0軟件計(jì)算物種種內(nèi)和種間的K2P遺傳距離，分析變異位點(diǎn)并構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹。綜合應(yīng)用相似性搜索法、最近距離法以及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹等進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果顯示，144份樣本的ITS2序列的擴(kuò)增效率和測序成功率均為100％，6種中藥材9個(gè)基原物種的ITS2序列長度范圍為194~221 bp?；谙嗨菩运阉鞣?，ITS2序列鑒定效率為88.9%?；贙2P模型計(jì)算遺傳距離，平車前、車前、青葙、

4、天仙子、獨(dú)行菜、播娘蒿、菟絲子、南方菟絲子、麥藍(lán)菜9個(gè)物種的最大種內(nèi)遺傳距離分別為0.005、0、0.009、0.005、0.010、0.021、0.005、0.034、0，小于9個(gè)物種的最小種間遺傳距離0.047；平車前、車前、獨(dú)行菜、播娘蒿、菟絲子、南方菟絲子和天仙子的最大種內(nèi)遺傳距離小于其與其混偽品的最小種間遺傳距離；青葙的最大種內(nèi)遺傳距離等于其與其混偽品的最小種間遺傳距離。NJ樹圖結(jié)果顯示，除平車前和青葙外，其余的7個(gè)物種均能各

5、自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性，與混偽品明顯的區(qū)分開。雖然基于NJ樹圖法，ITS2序列不能很好的區(qū)分平車前及其偽品大車前，但相似性搜索法和最近距離法的結(jié)果均證明ITS2序列能夠鑒別平車前及其混偽品。因此，ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒別除青葙子以外的5種細(xì)小種子類中藥材，為保障臨床用藥安全提供了有效的技術(shù)手段。
　?。?）本實(shí)驗(yàn)共收集57份菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)及其混偽品的樣本。隨機(jī)挑選24份菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)及其混偽品樣本，并對其matK、rb

6、cL、psbA-trnH和ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，比較各序列擴(kuò)增成功率、測序成功率、鑒定能力，結(jié)果顯示ITS2序列是最理想的DNA條形碼；PCR擴(kuò)增和測序剩余的33份樣品的ITS2序列，分析其種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹。最小距離法及NJ系統(tǒng)聚類樹圖均表明 ITS2序列能準(zhǔn)確鑒別菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)及其混偽品。另外，本研究應(yīng)用高效液相色譜法檢測菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)及其混偽品大青、木藍(lán)、水蓼、火炭母、球花馬藍(lán)以及中藥材青黛等3