ZNRD1在食管癌及EC109細胞中的表達及其臨床意義研究.pdf

1、背景: 食管癌是目前對人類健康和生命構成嚴重威脅的惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤導致的死亡中食管癌占第六位，在我國一些高發(fā)地區(qū)居于各種惡性腫瘤的首位。食管癌預后較差，主要原因是腫瘤在早期即可發(fā)生外侵或轉移。食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的后果。目前在食管癌組織中已發(fā)現多種表達異常的基因和蛋白，但具有臨床應用價值的分子標志物卻甚少，能夠對食管癌患者治療效果和預后判斷提供可靠依據的標志物尚需進一步研究證實和尋找。鋅帶蛋白基因l(Zi

2、nc ribbon domain-containing1，ZNRD1)是一種與轉錄相關的鋅帶蛋白，可能通過調節(jié)轉錄起始位點的選擇、RNA合成的延長和終止在轉錄中發(fā)揮重要調控作用。ZNRD1的表達可以抑制胃癌細胞系在體內外的生長和致瘤性，并且能夠抑制胃癌細胞系體外轉化表型，進而逆轉一些胃癌細胞系在體內外的惡性生長潛能，表明ZNRD1在腫瘤發(fā)展中能發(fā)揮一定的抑制作用，有可能是潛在的腫瘤基因治療靶點。ZNRD1在食管癌細胞內的作用、其抗凋亡的

3、機制、與食管癌發(fā)生有無關系等均未見報道。本研究一方面旨在探討ZNRD1在食管癌組織中的差異表達，了解ZNRD1表達水平與患者臨床病理特征和預后之間的關系；另外，以ZNRD1真核正義表達載體轉染人源性食管鱗癌細胞系EC109，構建ZNRD1基因高表達的食管鱗癌細胞亞系，探討ZNRD1過表達對EC109細胞增殖、凋亡、轉移以及DNA損傷修復等生物學行為的影響和作用機制，為深入理解ZNRD1在食管癌中的作用奠定理論基礎。研究結果可望為食管癌的

4、基因治療和預后判斷提供具有一定臨床應用價值的選擇。 目的: 研究ZNRD1基因在食管癌組織及其對應近癌、遠癌組織中的表達情況，了解ZNRD1表達水平與患者臨床病理特征和預后之間的關系，為ZNRDI作為食管癌預后判斷候選基因提供實驗依據；檢測食管鱗癌細胞系EC109中ZNRD1表達水平，構建ZNRDI表達上調的食管鱗癌細胞亞系，研究ZNRD1表達對食管鱗癌細胞系EC109增殖、凋亡以及轉移等生物學行為的影響和作用機制；探討

5、ZNRD1表達水平對EC109細胞化療藥物敏感性及DNA損傷修復功能的影響及其可能的分子機制。 方法: (1)應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫組織化學(IHC)技術檢測食管癌患者腫瘤組織及其對應近癌、遠癌組織中ZNRD1基因的表達； (2)采用IHC技術檢測食管癌患者腫瘤組織中ZNRD1蛋白的表達，結合隨訪資料進行統(tǒng)計分析； (3)應用RT-PCR、Western blot和免疫細胞化學(IC

6、C)技術檢測ZNRDI基因在食管鱗癌細胞系EC109中的表達； (4)利用脂質體轉染法建立ZNRD1基因過表達的食管鱗癌細胞模型，并利用RT-PCR和Western blot技術進行鑒定； (5)利用MTT實驗繪制轉染細胞、對照細胞及親本細胞的生長曲線； (6)通過Transwell侵襲小室實驗檢測ZNRD1過表達對食管鱗癌細胞侵襲活性的影響； (7)通過流式細胞儀分析轉染細胞及對照細胞的細胞周期和細胞凋

7、亡的變化； (8)通過MTT實驗進行體外藥物敏感性分析，計算細胞對藥物的IC50值； (9)通過流式細胞儀和DNA斷裂實驗檢測ZNRD1過表達對EC109細胞凋亡敏感性的影響； (10)利用單細胞凝膠電泳(SCGE)技術檢測紫外線(UV)照射對轉染細胞及其對照細胞的DNA損傷修復效應； (11)通過基因芯片檢測ZNRD1過表達對EC109細胞基因表達譜的影響； (12)利用RT-PCR和Weste

8、rn blot對基因芯片的結果進行鑒定。 結果: (1) ZNRD1在食管癌組織中的表達水平明顯低于近癌及遠癌組織；ZNRD1在食管癌患者腫瘤組織及其對應近癌、遠癌組織中的表達率分別為29.5％、52.3％和72.7％，ZNRD1在近癌及遠癌組織中的表達率顯著高于腫瘤組織(P<0.05)； (2)轉染細胞經RT-PCR和Western blot證實，成功建立了ZNRD1過表達的食管鱗癌細胞模型； (4)

9、MTT實驗及集落形成實驗結果表明，上調ZNRD1可以導致食管鱗癌細胞系EC109生長及增殖速度減慢； (5) Transwell侵襲小室實驗結果顯示，上調ZNRD1可以顯著降低食管鱗癌細胞系EC109的侵襲活性； (6)流式細胞儀檢測結果表明，上調ZNRD1可以導致EC109細胞出現G1期阻滯，S期比例減少； (7)體外藥物敏感實驗結果表明，上調ZNRD1能夠顯著降低EC109細胞對5一氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑

10、(CDDP)、長春新堿(VCR)和阿霉素(ADR)的敏感性，增強EC109細胞對化療藥物的耐受性； (8)流式細胞儀檢測及DNA斷裂實驗結果表明，上調ZNRD1可以降低EC109細胞對阿霉素的敏感性，增加食管鱗癌細胞株EC109的抗凋亡能力： (9) SCGE實驗結果表明，上調ZNRD1表達水平能夠顯著增強EC109細胞的DNA修復能力，抑制紫外線照射對食管鱗癌細胞EC109的DNA損傷效應； (10)基因芯片檢

11、測結果表明，上調ZNRD1可能改變61種基因的表達水平； (11)經RT-PCR和Western blot證實，轉染ZNRD1可以顯著上調ERCC1、P-gp、Bc1-2、和MDR1等基因的表達。 結論: ZNRD1在食管癌組織中的表達水平顯著低于對應近癌及遠癌組織；ZNRD1表達水平與患者預后呈正相關：腫瘤組織中ZNRD1表達水平高者其預后明顯優(yōu)于ZNRDI低表達患者。食管鱗癌細胞系EC109中ZNRDl mR

12、NA及蛋白表達均為陰性，上調ZNRD1可以在一定程度上逆轉食管鱗癌細胞系EC109的惡性表型，導致EC109細胞生長和增殖速度明顯減慢，細胞出現G1期阻滯，抑制EC109細胞的侵襲活性，ZNRD1可能通過調節(jié)CDKNIA等基因表達參與細胞周期調控。上調ZNRD1可以降低EC109細胞的藥物敏感性，抑制EC109細胞凋亡。ZNRD1可能通過調節(jié)DNA損傷修復相關基因ERCC1及Bcl-2的表達水平進而參與紫外線及鉑類化療藥物等DNA損傷因