ZNRD1在食管癌及EC109細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義研究.pdf

1、背景: 食管癌是目前對人類健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅的惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中食管癌占第六位，在我國一些高發(fā)地區(qū)居于各種惡性腫瘤的首位。食管癌預(yù)后較差，主要原因是腫瘤在早期即可發(fā)生外侵或轉(zhuǎn)移。食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的后果。目前在食管癌組織中已發(fā)現(xiàn)多種表達(dá)異常的基因和蛋白，但具有臨床應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物卻甚少，能夠?qū)κ彻馨┗颊咧委熜Ч皖A(yù)后判斷提供可靠依據(jù)的標(biāo)志物尚需進(jìn)一步研究證實(shí)和尋找。鋅帶蛋白基因l(Zi

2、nc ribbon domain-containing1，ZNRD1)是一種與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的鋅帶蛋白，可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇、RNA合成的延長和終止在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要調(diào)控作用。ZNRD1的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞系在體內(nèi)外的生長和致瘤性，并且能夠抑制胃癌細(xì)胞系體外轉(zhuǎn)化表型，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)一些胃癌細(xì)胞系在體內(nèi)外的惡性生長潛能，表明ZNRD1在腫瘤發(fā)展中能發(fā)揮一定的抑制作用，有可能是潛在的腫瘤基因治療靶點(diǎn)。ZNRD1在食管癌細(xì)胞內(nèi)的作用、其抗凋亡的

3、機(jī)制、與食管癌發(fā)生有無關(guān)系等均未見報(bào)道。本研究一方面旨在探討ZNRD1在食管癌組織中的差異表達(dá)，了解ZNRD1表達(dá)水平與患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系；另外，以ZNRD1真核正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109，構(gòu)建ZNRD1基因高表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞亞系，探討ZNRD1過表達(dá)對EC109細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移以及DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制，為深入理解ZNRD1在食管癌中的作用奠定理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果可望為食管癌的

4、基因治療和預(yù)后判斷提供具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值的選擇。 目的: 研究ZNRD1基因在食管癌組織及其對應(yīng)近癌、遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)情況，了解ZNRD1表達(dá)水平與患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，為ZNRDI作為食管癌預(yù)后判斷候選基因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；檢測食管鱗癌細(xì)胞系EC109中ZNRD1表達(dá)水平，構(gòu)建ZNRDI表達(dá)上調(diào)的食管鱗癌細(xì)胞亞系，研究ZNRD1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞系EC109增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制；探討

5、ZNRD1表達(dá)水平對EC109細(xì)胞化療藥物敏感性及DNA損傷修復(fù)功能的影響及其可能的分子機(jī)制。 方法: (1)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)檢測食管癌患者腫瘤組織及其對應(yīng)近癌、遠(yuǎn)癌組織中ZNRD1基因的表達(dá)； (2)采用IHC技術(shù)檢測食管癌患者腫瘤組織中ZNRD1蛋白的表達(dá)，結(jié)合隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； (3)應(yīng)用RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)(IC

6、C)技術(shù)檢測ZNRDI基因在食管鱗癌細(xì)胞系EC109中的表達(dá)； (4)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立ZNRD1基因過表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞模型，并利用RT-PCR和Western blot技術(shù)進(jìn)行鑒定； (5)利用MTT實(shí)驗(yàn)繪制轉(zhuǎn)染細(xì)胞、對照細(xì)胞及親本細(xì)胞的生長曲線； (6)通過Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測ZNRD1過表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞侵襲活性的影響； (7)通過流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋

7、亡的變化； (8)通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外藥物敏感性分析，計(jì)算細(xì)胞對藥物的IC50值； (9)通過流式細(xì)胞儀和DNA斷裂實(shí)驗(yàn)檢測ZNRD1過表達(dá)對EC109細(xì)胞凋亡敏感性的影響； (10)利用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)技術(shù)檢測紫外線(UV)照射對轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對照細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)效應(yīng)； (11)通過基因芯片檢測ZNRD1過表達(dá)對EC109細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響； (12)利用RT-PCR和Weste

8、rn blot對基因芯片的結(jié)果進(jìn)行鑒定。 結(jié)果: (1) ZNRD1在食管癌組織中的表達(dá)水平明顯低于近癌及遠(yuǎn)癌組織；ZNRD1在食管癌患者腫瘤組織及其對應(yīng)近癌、遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)率分別為29.5％、52.3％和72.7％，ZNRD1在近癌及遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)率顯著高于腫瘤組織(P<0.05)； (2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和Western blot證實(shí)，成功建立了ZNRD1過表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞模型； (4)

9、MTT實(shí)驗(yàn)及集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1可以導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞系EC109生長及增殖速度減慢； (5) Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)ZNRD1可以顯著降低食管鱗癌細(xì)胞系EC109的侵襲活性； (6)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1可以導(dǎo)致EC109細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，S期比例減少； (7)體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1能夠顯著降低EC109細(xì)胞對5一氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑

10、(CDDP)、長春新堿(VCR)和阿霉素(ADR)的敏感性，增強(qiáng)EC109細(xì)胞對化療藥物的耐受性； (8)流式細(xì)胞儀檢測及DNA斷裂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1可以降低EC109細(xì)胞對阿霉素的敏感性，增加食管鱗癌細(xì)胞株EC109的抗凋亡能力： (9) SCGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1表達(dá)水平能夠顯著增強(qiáng)EC109細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，抑制紫外線照射對食管鱗癌細(xì)胞EC109的DNA損傷效應(yīng)； (10)基因芯片檢

11、測結(jié)果表明，上調(diào)ZNRD1可能改變61種基因的表達(dá)水平； (11)經(jīng)RT-PCR和Western blot證實(shí)，轉(zhuǎn)染ZNRD1可以顯著上調(diào)ERCC1、P-gp、Bc1-2、和MDR1等基因的表達(dá)。 結(jié)論: ZNRD1在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)近癌及遠(yuǎn)癌組織；ZNRD1表達(dá)水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)：腫瘤組織中ZNRD1表達(dá)水平高者其預(yù)后明顯優(yōu)于ZNRDI低表達(dá)患者。食管鱗癌細(xì)胞系EC109中ZNRDl mR

12、NA及蛋白表達(dá)均為陰性，上調(diào)ZNRD1可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)食管鱗癌細(xì)胞系EC109的惡性表型，導(dǎo)致EC109細(xì)胞生長和增殖速度明顯減慢，細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，抑制EC109細(xì)胞的侵襲活性，ZNRD1可能通過調(diào)節(jié)CDKNIA等基因表達(dá)參與細(xì)胞周期調(diào)控。上調(diào)ZNRD1可以降低EC109細(xì)胞的藥物敏感性，抑制EC109細(xì)胞凋亡。ZNRD1可能通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因ERCC1及Bcl-2的表達(dá)水平進(jìn)而參與紫外線及鉑類化療藥物等DNA損傷因