血管性認(rèn)知功能障礙小鼠海馬組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化及氯化鋰的干預(yù)作用.pdf

1、目的:血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是由各種腦血管疾病引起的以學(xué)習(xí)、記憶功能損害為主要癥狀的智能障礙綜合征，其是一種慢性進(jìn)行性疾病，可最終發(fā)展至不可逆轉(zhuǎn)的程度。隨著人口老齡化的加劇，VCI給個人、家庭以及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，因而尋找一種有效的治療藥物刻不容緩。近年來許多研究表明，反復(fù)腦缺血再灌注損傷是VCI的主要病因之一，因此探討反復(fù)腦缺血再灌注損傷致VCI的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的

2、治療藥物成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。
　　反復(fù)腦缺血再灌注可誘導(dǎo)線粒體損傷，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，其可使功能異常的蛋白質(zhì)及損害的細(xì)胞器積聚，從而激活自噬(autophagy)，引起細(xì)胞自噬性死亡。研究表明糖原合成酶激酶-3β/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路(glycogen synthasekinase-3β/mammalian target of rapamycin，GSK3β/

3、mTOR)在拮抗自噬過度激活中發(fā)揮著重要的作用。
　　氯化鋰(lithium chloride)一直用來治療躁狂-抑郁性疾病，近年來研究證實(shí)氯化鋰可改善神經(jīng)退行性疾病及急性腦損傷誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。盡管氯化鋰對于改善認(rèn)知功能具有多種機(jī)制，但其是否通過調(diào)控GSK3β/mTOR通路而抑制自噬改善認(rèn)知功能障礙尚未見報道。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)反復(fù)腦缺血再灌注損傷致VCI小鼠模型腹腔注射氯化鋰2mmol/kg可磷酸化GSK3β，從而抑

4、制GSK3β的活性?；谝陨涎芯?，本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法建立VCI小鼠模型，觀察小鼠術(shù)前預(yù)防性應(yīng)用氯化鋰或術(shù)后治療性應(yīng)用氯化鋰能否改善認(rèn)知功能，并進(jìn)一步探討其是否與通過激活mTOR通路而抑制自噬有關(guān)。
　　方法:以8周齡24-26g雄性C57BL/6小鼠為研究對象，采用反復(fù)三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈（bilateral common carotid artery，BCCA）的方法，給予腦缺血20min-再灌注10min處理

5、，建立VCI小鼠模型。實(shí)驗(yàn)1:將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組，手術(shù)組按照術(shù)后不同時間點(diǎn)分為1d、3d、7d、14d、28d5個亞組。將各組小鼠分別于相應(yīng)時間點(diǎn)處死后，采用western blot觀察VCI發(fā)病過程中mTOR、p-mTOR、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白水平的動態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)2:將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、VCI模型組(Vehicle)、氯化鋰預(yù)防組(Pre-Li)及氯化鋰治療組(Li

6、)。假手術(shù)組和VCI模型組給予等體積生理鹽水;氯化鋰預(yù)防組術(shù)前腹腔注射氯化鋰2mmol/kg連續(xù)7d，氯化鋰治療組術(shù)后腹腔注射氯化鋰2mmol/kg連續(xù)14d。2周后各組通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績測試，觀察其空間認(rèn)知能力的變化。水迷宮測試結(jié)束后，采用尼氏染色觀察各組小鼠海馬組織病理學(xué)變化及透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用westemblot觀察各組小鼠海馬mTOR、p-mTOR、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)變

7、化。
　　結(jié)果:
　　1、空間認(rèn)知能力變化—水迷宮結(jié)果
　　1.1定位航行實(shí)驗(yàn):各組小鼠尋臺潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)逐漸縮短。VCI模型組小鼠與假手術(shù)組小鼠相比，從入水到找到平臺的時間（尋臺潛伏期）明顯延長(P＜0.01);氯化鋰預(yù)防組及治療組小鼠較VCI模型組小鼠相比，尋臺潛伏期明顯縮短(P＜0.01)。
　　1.2空間探索實(shí)驗(yàn):選用目標(biāo)象限停留時間百分比進(jìn)行測定。與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠在原平臺所在象限（目

8、標(biāo)象限）停留時間所占百分比降低（P＜0.01），氯化鋰預(yù)防組在原平臺所在象限停留時間百分比較VCI模型組明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而氯化鋰治療組在原平臺象限停留時間雖然較VCI模型組增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、尼氏染色結(jié)果
　　假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列緊密、均勻，無神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)完整，胞漿尼氏體豐富，胞核大而圓，核仁清晰可見。與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠可見CA1區(qū)神經(jīng)

9、元部分缺失，且排列疏松，神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，胞體、胞核固縮。給予氯化鋰干預(yù)后，上述情況得到明顯改善，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失明顯減少，可見少量胞核固縮。
　　3、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化—透射電鏡結(jié)果
　　假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器豐富，且粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無脫顆?，F(xiàn)象，胞核完整，染色質(zhì)均勻一致。與假手術(shù)組相比，VCI模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞膜不規(guī)則，有不同程度的水腫，細(xì)胞器數(shù)量明顯

10、減少，線粒體變少、嚴(yán)重者有空泡化現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)分布不均勻。經(jīng)氯化鋰干預(yù)后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善。
　　4、Western blot結(jié)果
　　4.1 VCI小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白動態(tài)表達(dá)
　　反復(fù)腦缺血再灌注損傷后小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高。P-mTOR、Beclin1蛋白表達(dá)與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值于1d開始升高，14d達(dá)到高峰，并持續(xù)到本實(shí)驗(yàn)觀察到的28

11、d（P＜0.01）。
　　4.2氯化鋰對VCI小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　同假手術(shù)組小鼠相比，VCI模型組小鼠海馬組織p-mTOR蛋白表達(dá)輕微升高（P＜0.01）;經(jīng)氯化鋰干預(yù)后，p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯升高，與VCI模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。經(jīng)氯化鋰干預(yù)后Beclin1蛋白表達(dá)與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較VCI模型組明顯降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)腦缺血再灌注方法成功