氯化鋰對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙小鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment, VCI)是由各種腦血管疾病引起的以學(xué)習(xí)記憶功能損害為主要癥狀的智能障礙綜合征。隨著我國(guó)老年人口規(guī)模的增加和老齡化速度的加快，腦血管病的發(fā)病率也逐年增高，嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量，并有年輕化的趨勢(shì)。腦血管病除了引起肢體功能障礙以外，還會(huì)引起認(rèn)知功能障礙和情緒異常。因此早期采取積極有效的預(yù)防和治療對(duì)減輕患者個(gè)人及家庭的負(fù)擔(dān)具有重要意義。
　　反復(fù)腦缺血

2、再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷是VCI重要的病理生理學(xué)機(jī)制之一。制備反復(fù)腦IR動(dòng)物模型能很好的模擬臨床患者VCI的過程，是研究VCI發(fā)病機(jī)制的有效方法。眾所周知，鋰劑是一種治療雙向情感障礙的情緒穩(wěn)定劑。近年鋰劑也作為一種治療神經(jīng)退行性疾病和腦血管性疾病的神經(jīng)保護(hù)性藥物使用。但是，鋰劑對(duì)反復(fù)腦IR引起學(xué)習(xí)記憶損害的分子機(jī)制還不十分清楚。
　　研究表明，海馬是學(xué)習(xí)、記憶的主要場(chǎng)所，也是缺血易損區(qū)。蛋白激酶

3、B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β，GSK-3β)信號(hào)通路是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子依賴性信號(hào)通路中的主要成員，在改善海馬學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用。反復(fù)腦IR導(dǎo)致大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化損傷，及時(shí)有效的減輕氧化應(yīng)激損傷可能是防治VCI的可行方法之一。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derive

4、d neurotrophic factor, BDNF)是腦內(nèi)最豐富的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，缺乏生長(zhǎng)因子可促進(jìn)神經(jīng)凋亡。BDNF也能通過刺激B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)家族成員表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的效果。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)是BDNF基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過133位絲氨酸磷酸化激活

5、的CREB參與突觸可塑性、長(zhǎng)時(shí)記憶形成和鞏固。
　　基于上述研究背景，我們采用反復(fù)三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(bilateralcommon carotid artery occlusion，BCCAO)的方法，建立反復(fù)腦IR損傷致VCI小鼠模型，術(shù)前或術(shù)后應(yīng)用不同劑量氯化鋰(lithium chloride，LiCl)進(jìn)行干預(yù)，觀察:(1) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)Akt、GSK-3β蛋白表達(dá)改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬組織形態(tài)學(xué)異常;(

6、2) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性等指標(biāo)，抑制氧化應(yīng)激損害;
　　(3) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、BDNF、CREB基因或蛋白表達(dá)抑制凋亡、激活BDNF/CREB信號(hào)通路以改善認(rèn)知功能。
　　第一部分氯化鋰對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙小鼠Akt/GSK-3β通路的影響
　　目的:通過反復(fù)三次BCCAO法建立VCI小鼠模型，觀察術(shù)后2周、4周、6周Akt和GSK-3

7、β活性改變是否參與了反復(fù)腦IR致學(xué)習(xí)記憶損害，并進(jìn)一步探討2mmol/Kg LiCl術(shù)后給藥是否能通過增強(qiáng)或抑制這種變化發(fā)揮治療認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:清潔級(jí)健康雄性C57B1/6小鼠(C57小鼠)144只，隨機(jī)分為4組:(1)氯化鈉假手術(shù)組(NaCl-treated sham group，n=36);(2)氯化鈉模型組(NaCl-treated model group，n=36);(3)氯化鋰假手術(shù)組(LiCl-

8、treatedsham group，n=36);(4)氯化鋰模型組(LiCl-treated model group，n=36)。每組于術(shù)后2周、4周、6周進(jìn)行觀察（每亞組12只）。模型組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎20min，放開10min，反復(fù)循環(huán)三次的方法制備VCI模型。LiCl組小鼠術(shù)后給予每天一次腹腔注射2mmol/Kg LiCl。最后一次給藥的次日，采用水迷宮自動(dòng)記錄儀對(duì)所有存活小鼠進(jìn)行為期4天的水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄第3天和第4天小鼠找

9、到逃生梯的時(shí)間（游泳時(shí)間）和進(jìn)入盲端的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）作為評(píng)測(cè)學(xué)習(xí)和記憶功能的指標(biāo)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，采用HE染色觀察小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化，TUNEL染色觀察海馬組織神經(jīng)元凋亡變化，Western blot法分析Akt和GSK-3β蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:在NaCl和LiCl模型組小鼠，死亡率分別為16.67％和11.11％。其中，NaCl模型組小鼠術(shù)后2周、4周、6周各死亡小鼠2、1、3只;LiCl模型組小鼠術(shù)后2周、4周、

10、6周各死亡小鼠1、1、2只。假手術(shù)組小鼠術(shù)后未見死亡。
　　行為學(xué)測(cè)試中，術(shù)前各組小鼠學(xué)習(xí)階段和記憶階段游泳時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)無明顯差異，認(rèn)知功能水平基本相同(P＞0.05)。術(shù)后，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠學(xué)習(xí)階段和記憶階段游泳時(shí)間均延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均增多（p＜0.05）。與NaCl組小鼠相比，LiCl組小鼠游泳時(shí)間明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。在術(shù)后2周、4周、6周整個(gè)觀察期間，這種作用持續(xù)存在，但以術(shù)后4周最明顯。<

11、br>　　HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl和LiCl假手術(shù)組小鼠海馬錐體細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密有序，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，極少見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。相比之下，NaCl模型組小鼠術(shù)后4周、6周海馬錐體細(xì)胞數(shù)量減少，排列松散，細(xì)胞核固縮深染，核仁消失，并可見大量TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元(P＜0.05)。術(shù)后4周損傷最明顯，部分區(qū)域僅見少量神經(jīng)元存活。LiCl組細(xì)胞數(shù)量減少和核固縮不明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0.05)。尤其在術(shù)后4周和6周改善明顯。

12、
　　Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LiCl模型組小鼠phospho-AktSer473和phospho-GSK-3β Ser9蛋白表達(dá)增高(P＜0.05)。NaCl模型組小鼠phospho-Akt Ser473和phospho-GSK-3β Ser9蛋白表達(dá)比假手術(shù)組小鼠也有增高，但增高程度低于LiCl組小鼠。這兩種蛋白表達(dá)量以術(shù)后4周增高最明顯。
　　結(jié)論:反復(fù)腦IR法制備的VCI小鼠模型，能有效的模擬學(xué)習(xí)

13、記憶功能障礙和海馬形態(tài)學(xué)異常，給予術(shù)后不同時(shí)間2 m1mol/kg LiCl處理均可不同程度改善海馬形態(tài)學(xué)異常，減輕凋亡反應(yīng)，激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高VCI小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，改善認(rèn)知功能。
　　第二部分氯化鋰不同劑量和不同時(shí)間給藥對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙小鼠認(rèn)知功能和海馬組織形態(tài)學(xué)的影響
　　目的:給予VCI小鼠術(shù)前和術(shù)后2 mmol/kg或5mmol/kg LiCl處理，術(shù)后4周利用Morris水迷宮進(jìn)行

14、行為學(xué)測(cè)試，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)異常，進(jìn)一步探討LiCl改善認(rèn)知功能的作用。
　　方法:60只C57小鼠隨機(jī)分為6組:(1)假手術(shù)組(sham group);(2)模型組(vehicle group);(3)氯化鋰低劑量術(shù)前組(pre-LiCl-low model group，pre-Li-L);(4)氯化鋰低劑量術(shù)后組(LiCl-low model group，Li-L);(5)氯化鋰高劑量術(shù)前組(pre-LiCl-hi

15、gh model group，pre-Li-H);(6)氯化鋰高劑量術(shù)后組(LiCl-highmodelgroup，Li-H)。每組10只。模型組、LiCl術(shù)前組和術(shù)后組均采用三次BCCAO致反復(fù)腦IR法制備VCI模型。LiCl術(shù)前組于造模前連續(xù)7天給予每天一次2 mmol/kg（低劑量）或5mmol/kg（高劑量）LiCl腹腔注射，LiCl術(shù)后組于造模后給予每天一次2 mmol/kg（低劑量）或5 mmol/kg（高劑量）LiCl腹腔

16、注射，連續(xù)28天。最后一次給藥的次日，所有存活小鼠進(jìn)行為期6天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(Place navigation test):連續(xù)訓(xùn)練5天，每天訓(xùn)練6次，記錄小鼠從入水到尋臺(tái)成功的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency)，反映小鼠空間學(xué)習(xí)能力。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(Spatial probe test):在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第二天，撤除平臺(tái)，記錄小鼠60s內(nèi)在原平臺(tái)象限的停留

17、時(shí)間占總時(shí)間的百分比（目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比）以及穿過原來平臺(tái)所在位置的次數(shù)（穿臺(tái)次數(shù)），反映小鼠空間記憶能力。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化并對(duì)正常神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果:在定位航行階段，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短。從訓(xùn)練第2天開始，VCI小鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組小鼠明顯延長(zhǎng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);第3天，低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠表現(xiàn)出逃避潛伏期較VCI模

18、型組小鼠明顯縮短(P＜0.05);第4、5天低劑量術(shù)前組、低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠逃避潛伏期均較VCI模型組小鼠明顯縮短(P＜0.05)，低劑量術(shù)后組差異最明顯。同時(shí)經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，高劑量術(shù)前組小鼠逃避潛伏期較低劑量術(shù)前組縮短，而高劑量術(shù)后組卻較低劑量術(shù)后組延長(zhǎng)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在空間探索階段，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比明顯降低(P＜0.05)，穿臺(tái)次數(shù)也明顯減少（P＜0.05）。與VCI

19、模型組小鼠相比，低劑量術(shù)前組、低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比均明顯增加(P＜0.05)，穿臺(tái)次數(shù)也明顯增加(P＜0.05)。
　　行為學(xué)測(cè)試完畢后，尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列緊密、均勻，層次清楚，細(xì)胞形態(tài)、大小正常，結(jié)構(gòu)完整，胞核大而圓，核仁清晰可見，胞漿尼氏體豐富。與假手術(shù)組相比，術(shù)后4周VCI模型組小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元缺失明顯，排列疏松，錐體神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則

20、，神經(jīng)元胞體呈梭形或多角形，胞核固縮，正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯減少(P＜0.05)。給予2mmol/Kg和5mmol/KgLiCl術(shù)前和術(shù)后給藥處理后，上述異常都明顯減輕，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元丟失明顯減少，正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯增多(P＜0.05)，細(xì)胞排列較為緊密有序，存活細(xì)胞邊緣較清晰，胞體形態(tài)較飽滿，可見少量胞核固縮，以低劑量術(shù)后組改善最明顯。
　　結(jié)論:反復(fù)腦IR損傷制備的VCI小鼠術(shù)后4周在Morris水迷宮測(cè)試中表現(xiàn)出明顯的空

21、間學(xué)習(xí)記憶功能受損，伴有海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常、數(shù)量減少，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl術(shù)前和術(shù)后給藥都能明顯改善行為學(xué)異常、增加存活神經(jīng)元數(shù)量，以低劑量術(shù)后給藥效果最好。
　　第三部分氯化鋰不同劑量和不同時(shí)間給藥對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙小鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的:觀察反復(fù)腦IR后不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的動(dòng)態(tài)變化，探討氧化應(yīng)激損傷在反復(fù)腦IR中的作用

22、，并觀察LiCl不同劑量和不同時(shí)間給藥對(duì)海馬組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的影響，探討LiCl是否能通過提高抗氧化酶活性和降低自由基作用，達(dá)到減輕氧化應(yīng)激損傷、發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　方法:第一階段:24只C57小鼠隨機(jī)分為6組:(1)假手術(shù)組(shamgroup);(2)術(shù)后1天組(1d);(3)術(shù)后3天組(3d);(4)術(shù)后7天組(7d);(5)術(shù)后14天組(14d);(6)術(shù)后28天組(28d)。每組

23、4只。第二階段:分組情況同第二部分。對(duì)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)以及LiCl不同劑量和不同時(shí)間給藥的各組小鼠海馬組織，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)海馬組織MDA含量，WST-1法檢測(cè)SOD活性、化學(xué)比色法檢測(cè)GSH-PX活性和可見光法檢測(cè)CAT活性。
　　結(jié)果:與假手術(shù)組相比，術(shù)后1天、3天、7天、14天和28天，MDA含量持續(xù)增高，7天時(shí)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，28天時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。而術(shù)后1天、3天、7天、14天和2

24、8天，SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性均明顯減低(P＜0.05)，以7天時(shí)最明顯(P＜0.05)，28天時(shí)仍明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。
　　與VCI模型組小鼠術(shù)后4周相比，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能明顯降低MDA含量(P＜0.05)、提高SOD活性(P＜0.05)和GSH-PX活性(P＜0.05)。經(jīng)SNK法兩兩比較發(fā)現(xiàn)，采用術(shù)前給藥時(shí)，5mmol/Kg效果好;采用術(shù)后給藥

25、時(shí)，2mmol/Kg效果好，4組比較而言，以低劑量術(shù)后組最好，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與VCI模型組小鼠術(shù)后4周相比，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能不同程度提高CAT活性，但只有在低劑量術(shù)后組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:反復(fù)腦IR后1天、3天、7天、14天和28天，氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，引起自由基生成過多或清除能力下降，抑制多種抗氧化物酶活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷。2mmol/Kg

26、和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能通過提高多種抗氧化物酶活性，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少自由基含量，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第四部分氯化鋰不同劑量和不同時(shí)間給藥對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙小鼠海馬組織凋亡蛋白和BDNF/CREB信號(hào)通路的影響
　　目的:觀察反復(fù)腦IR后不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的動(dòng)態(tài)變化，探討凋亡在反復(fù)腦IR中的作用，并檢測(cè)術(shù)前或術(shù)后給予2mmol/Kg或5mmol/Kg Li

27、Cl能否通過抑制VCI小鼠凋亡、上調(diào)BDNF和p-CREB等重要蛋白表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:按照第三部分進(jìn)行分組和模型制備。Western blot法檢測(cè)反復(fù)腦IR后不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time-qPCR，RT-qPCR)法和Western blot法檢測(cè)術(shù)前或術(shù)后給予不同劑量LiCl后Bcl-2、Bax、BDNF、CREB、p-CREB基因或蛋白的

28、表達(dá)情況。
　　結(jié)果:Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2/Bax比值均降低(P＜0.05)，術(shù)后7天達(dá)到最低。各時(shí)間點(diǎn)間Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。與假手術(shù)組相比，反復(fù)腦IR損傷導(dǎo)致BDNF表達(dá)持續(xù)升高，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　術(shù)前給予5mmol/kg LiCl能明顯上調(diào)反復(fù)腦IR導(dǎo)致的Bcl-2/Bax比值降低（上調(diào)35％）(

29、P＜0.05)。術(shù)前和術(shù)后給予2mmol/kg LiCl可將Bcl-2/Bax比值分別上調(diào)9％和17％，但不如高劑量術(shù)前組效果明顯。各組Bcl-2蛋白的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠海馬組織BDNF mRNA水平明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，術(shù)前和術(shù)后給予LiCl治療都能明顯增加BDNF mRNA水平(P＜0.05)，在4個(gè)LiCl處理組中，以低劑量術(shù)后

30、組增高最明顯。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與VCI模型組相比，術(shù)后2mmol/kg LiCl能明顯增加BDNF蛋白表達(dá)（上調(diào)51％，P＜0.05）。術(shù)前2mmol/kg，術(shù)前5mmol/kg和術(shù)后5mmol/kg LiCl處理對(duì)BDNF的表達(dá)也分別上調(diào)了35％，32％和32％。術(shù)前5mmol/kg LiCl能明顯上調(diào)phospho-CREB Ser133蛋白表達(dá)(上調(diào)33％)(P＜0.05)。各組間CREB蛋白表達(dá)未見明顯改變(p