基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1α)對(duì)大鼠顱腦損傷(TBI)影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　SDF-1通過(guò)與其表面受體CXCR4特異性結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，其在正常腦中含量很低。最初關(guān)于SDF-1的研究主要是在造血方面，現(xiàn)有的研究多集中在其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷的修復(fù)作用以及它在腫瘤中對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的影響，而鮮有文章研究其對(duì)凋亡的影響。在SDF-1對(duì)局部損傷組織的炎性因子影響研究中，一些研究表明其有抗炎作用而又有研究表明其具有促進(jìn)炎癥作用，在這方面存在很大的爭(zhēng)議。有關(guān)SDF-1在顱腦損傷中的作用的報(bào)道表明

2、損傷發(fā)生后SDF-1能誘導(dǎo)腦組織中血管的生成，起到修復(fù)的作用。
　　針對(duì)以上現(xiàn)狀，本研究首次從凋亡蛋白Caspase-3、PARP以及凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bax途徑探討SDF-1在大鼠顱腦損傷后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，并輔以TUNEL法加以驗(yàn)證。通過(guò)檢測(cè)ERK和NF-κB通路的活化情況明確SDF-1在顱腦損傷中到底是起到促進(jìn)炎癥還是抑制炎癥的作用。以期為深入地探討SDF-1對(duì)顱腦損傷的修復(fù)作用機(jī)制，為顱腦損傷的治療提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

3、。
　　材料與方法：
　　一、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)對(duì)大鼠顱腦損傷的影響
　　1、雄性SD大鼠共100只，隨機(jī)分為一下五組:1）假手術(shù)組(sham)，2)顱腦損傷組(TBI)，3)顱腦損傷組+SDF-1組(TBI+SDF-1)，4)顱腦損傷+SDF-1抗體組(TBI+antibody)5)顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)。SDF-1所用劑量為4μg溶于4μl生理鹽水中。SDF-1抗體所用劑量為

4、4μg溶于4μl生理鹽水中。大鼠造模采用Marmarous等人的方法，用40g擊錘從30cm高處沿套管呈自由落體沖擊于致傷墊，造成頂葉局部陛腦挫裂傷。造模成功30分后，給與SDF-1或SDF-1抗體。顱腦損傷24小時(shí)后處死各組大鼠，取出腦組織，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌扇〔煌绞绞占瘶颖?。?duì)于腦水腫的檢測(cè)，大鼠處死后迅速取出腦組織，置于冰上備用。對(duì)于血腦屏障完整性檢測(cè)，在大鼠損傷后23h注射2％伊文思藍(lán)，一小時(shí)后灌注生理鹽水去除血管內(nèi)的伊文

5、思藍(lán)染料。對(duì)于其他檢測(cè)，大叔灌注0.9％肝素的預(yù)冷生理鹽水250ml后，處死大鼠，液氮速凍后，置于-80度冰箱備用。
　　2、伊文思藍(lán)溢出(evans blue extravasation)法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中，血腦屏障完整性.
　　3、甲苯酚紫(Cresyl Violet)染色法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中神經(jīng)元存活情況，并統(tǒng)計(jì)單個(gè)視野中存活的神經(jīng)元數(shù)目。
　　二、SDF-1α對(duì)大鼠顱腦損傷后細(xì)胞增殖、凋亡的影

6、響
　　1、免疫組化檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況。
　　2、TUNEL法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織細(xì)胞凋亡情況。
　　3、Western blot檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2和Bax的表達(dá)。
　　三、SDF-1α對(duì)大鼠顱腦損傷后炎性因子，NO及胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)途徑分子的影響
　　1、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組大鼠大腦皮層

7、組織中TNF-α，IL-6和IL-1β等炎性因子的表達(dá)水平。
　　2、Griess反應(yīng)法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中NO的含量。
　　3、定時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中iNOS的表達(dá)水平。
　　4、Western blot檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中AKT、p-AKT、p65 NF-Kb、p-p65NF-kB的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　結(jié)果一:
　　1、大鼠遭受自

8、由落體打擊后:大鼠肢體抽搐，并呼吸抑制（約10-15 s），部分大鼠出現(xiàn)前肢屈曲，后肢強(qiáng)直，證明大鼠顱腦損傷模型建模成功。
　　2、與假手術(shù)組對(duì)比:模型組與注射SDF-1α抗體組和注射生理鹽水組EB溢出量明顯增加，SDF-1α抗體組比模型組腦含水量與EB溢出量略高，模型組與注射生理鹽水組相當(dāng)。與模型組相比，SDF-1α組腦含水量與EB溢出量明顯降低。
　　3、甲苯酚紫(Cresyl Violet)染色法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組

9、織中神經(jīng)元存活結(jié)果表明:在sham組中，大腦皮層組織中神經(jīng)元胞體相對(duì)較大，胞質(zhì)濃密，含有1到2個(gè)較大的核。而TBI損傷組中，損傷神經(jīng)元胞體出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞核濃縮，胞質(zhì)深染，并可見(jiàn)空腔囊泡。TBI+vehicle組與TBI組表現(xiàn)出相似結(jié)果。與TBI組相比，加入SDF-1α后，可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞胞體萎縮程度有顯著緩解，少見(jiàn)分細(xì)胞核濃縮，大部分細(xì)胞胞質(zhì)濃密，細(xì)胞核清晰。而加入antibody組，神經(jīng)元細(xì)胞萎縮現(xiàn)象加重，胞質(zhì)深染，細(xì)胞核不清晰，出現(xiàn)濃

10、縮。
　　結(jié)果二:
　　1、檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況結(jié)果顯示:在sham組中，PCNA表達(dá)呈現(xiàn)陰性或弱表達(dá)，損傷后，TBI組PCNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。而在TBI+SDF-1α組中，大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的PCNA表達(dá)增強(qiáng)，在加入antibody后表達(dá)下調(diào)，TBI+vehicle組PCNA達(dá)與TBI組相似。
　　2、TUNEL法檢測(cè)各

11、組大鼠大腦皮層組織細(xì)胞凋亡情況TUNEL結(jié)果顯示，在sham組中，大腦皮層區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)明顯凋亡現(xiàn)象，神經(jīng)元胞體正常，無(wú)固縮及破碎現(xiàn)象，細(xì)胞染色淡。而在TBI處理組及TBI+vehicle組中皮層神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯固縮，凋亡現(xiàn)象明顯，細(xì)胞染色顯著增強(qiáng)。相比TBI組，TBI+SDF-1α組皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減弱，而在加入antibody后，細(xì)胞凋亡趨勢(shì)有所增強(qiáng)。提示SDF-1α可能有抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　3、WB檢測(cè)SDF-1α

12、對(duì)大鼠顱腦損傷后細(xì)胞增殖、凋亡的影響cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(sham)，并且有顯著差異，說(shuō)明大鼠顱腦損傷后發(fā)生細(xì)胞凋亡。顱腦損傷后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax表達(dá)比模型組降低，且有差異，但仍高于假手術(shù)組，說(shuō)明SDF-1α有一定的治療作用。顱腦損傷+ SDF-1α抗

13、體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯升高，且有顯著性差異，說(shuō)明顱腦損傷后再加入SDF-1α抗體，細(xì)胞凋亡更明顯，損傷更嚴(yán)重。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。Bcl-2在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯低于假手術(shù)組（sham），并且有顯著差異
　　顱腦損傷后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，Bcl-2表達(dá)比模型組升高，且有差異，但仍低于假手術(shù)組。

14、顱腦損傷+ SDF-1α抗體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯降低，且有顯著性差異。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)果三:
　　1、試劑盒法檢測(cè)SDF-1α對(duì)大鼠顱腦損傷后炎性因子、NO及胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)途徑分子的影響IL-6、TNF-α、IL-1β在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（sham），并且有顯著差異，說(shuō)明大鼠顱腦損傷后

15、發(fā)生炎性反應(yīng)。顱腦損傷后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)比模型組降低，且有差異，但仍高于假手術(shù)組，說(shuō)明SDF-1α有一定的治療作用。顱腦損傷+SDF-1α抗體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯升高，且有顯著性差異，說(shuō)明顱腦損傷后再加入SDF-1α抗體，細(xì)胞炎性反應(yīng)更明顯，損傷更嚴(yán)重。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。

16、
　　2、NO在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(sham)，并且有顯著差異。顱腦損傷后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，NO表達(dá)比模型組降低，且有差異，但仍高于假手術(shù)組。顱腦損傷+ SDF-1α抗體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯升高，且有顯著性差異。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。
　　3、iNOS、p-ERK、p-p6

17、5 NF-κB在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(sham)，并且有顯著差異，顱腦損傷后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，iNOS、p-ERK、p-p65 NF-κB表達(dá)比模型組降低，且有差異，但仍高于假手術(shù)組。顱腦損傷+ SDF-1α抗體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯升高，且有顯著性差異。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。
　　

18、4、p-AKT在顱腦損傷模型組(TBI)中表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（sham），并且有顯著差異，顱腦損傷后加入SDF-1α（TBI+SDF-1α），p-AKT表達(dá)比模型組更高，且有差異。顱腦損傷+ SDF-1α抗體組(TBI+antibody)與模型組(TBI)組比較，明顯降低，且有顯著性差異。顱腦損傷+生理鹽水組(TBI+vehicle)與模型組(TBI)比較，無(wú)顯著性差異。ERK、p65 NF-κB、AKT各組間表達(dá)比較，均無(wú)差異。

19、r>　　結(jié)論：
　　1、 SDF-1α組與對(duì)照組及抗體組相比，EB溢出量明顯降低。表明SDF-1α保護(hù)血腦屏障完整性的作用，同時(shí)有抑制損傷神經(jīng)元胞體出現(xiàn)萎縮的作用，從而減輕腦損傷的程度。
　　2、通過(guò)對(duì)各組間(PCNA)，cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax，Bcl-2的不同表達(dá)情況的比較表明:SDF-1α有促進(jìn)TBI后的細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　3、試劑盒法檢測(cè)SDF-1α對(duì)