RNAi阻抑急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1對共培養(yǎng)Jurkat細胞的影響.pdf

1、目的：急性白血病是血液系統(tǒng)常見的惡性疾病，大部分患者經過傳統(tǒng)化療后能獲得初始的的緩解，但即使進行現代大劑量化療和造血干細胞移植，仍有相當部分的病人難免最終復發(fā)。骨髓微小殘留病被認為是復發(fā)的根源，而殘留的白血病細胞的生存離不開骨髓造血微環(huán)境的支持，造血微環(huán)境異?？赡軈⑴c了微小殘留病的形成，因此改造骨髓造血微環(huán)境可能成為治療急性白血病的新策略?；|細胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor-1，SDF-1)主要由骨髓

2、基質細胞合成和分泌，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。人SDF-1基因定位于10號染色體，根據其編碼氨基酸序列歸屬于趨化因子CXC亞家族，通過與造血干細胞和血液腫瘤細胞上其受體CXCR4結合，不僅在細胞的遷移和定位中發(fā)揮重要作用，而且影響瘤細胞的擴增。有報道通過應用受體阻斷劑能抑制瘤細胞生存，但抑制骨髓基質細胞表達SDF-1對急性白血病細胞有什么影響目前還不清楚。我們通過觀察RNA干擾抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1對共培養(yǎng)的急性

3、白血病Jurkat細胞的影響，探索通過改造骨髓造血微環(huán)境清除微小殘留病治療急性白血病的途徑。 方法：參照Dexter法分離培養(yǎng)完全緩解1年內的急性白血病骨髓基質細胞，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中SDF-1含量，脂質體介導SDF-1特異性RNA干擾質粒轉染骨髓基質細胞，G418篩選陽性混合克隆(命名為SC1)，RT-PCR及ELISA法檢測RNA干擾后骨髓基質細胞SDF-1mRNA和蛋白表達水平，以轉染對照質粒骨髓基質細胞(命名為S

4、C2)和未轉染的骨髓基質細胞(命名為SC3)作為對照。Jurkat細胞與急性白血病骨髓基質細胞共培養(yǎng)，與轉染RNA干擾質粒抑制SDF-1表達的骨髓基質細胞共培養(yǎng)的Jurkat細胞作為實驗組(A組)，與未轉染的骨髓基質細胞共培養(yǎng)的Jurkat細胞作為對照組(B組)。通過檢測Jurkat細胞的黏附、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、PCNA,Bcl-2,Bax,Fas,FasL的表達及藥物敏感性的變化，評估RNA干擾抑制SDF-1表達的作用。細

5、胞黏附和細胞增殖試驗采用細胞計數法檢測，細胞周期、細胞凋亡、PCNA,Bcl-2,Bax,Fas,FasL的表達、藥物敏感性試驗分別采用流式細胞術、TdT介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法、免疫細胞化學、MTT法檢測。 結果：實驗主要結果如下：1.急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1ELISA檢測結果顯示，急性白血病完全緩解1年內骨髓基質細胞培養(yǎng)上清SDF-1含量為(2891±305)pg/ml，正?；驘o重大血液系統(tǒng)疾病

6、骨髓基質細胞培養(yǎng)上清SDF-1含量為(1583±157)pg/ml，前者明顯高于后者(P＜0.05)，表明急性白血病完全緩解1年內骨髓基質細胞仍過度表達SDF-1。 2.RNA干擾后急性白血病骨髓基質細胞SDF-1mRNA和蛋白的表達RT-PCR結果顯示，SC1、SC2和SC3細胞SDF-1與內對照β-actin光密度比值分別為0.20、1.46和1.48，ELISA結果顯示，SC1、SC2和SC3細胞培養(yǎng)上清SDF-1蛋白含量

7、分別為(384±41)pg/ml、(2428±299)pg/ml和(2474±271)pg/ml，SC1細胞mRNA和蛋白水平明顯低于對照組，表明RNA干擾明顯抑制了SDF-1的表達。 3.抑制急性白血病骨髓基質細胞SDF-1表達對共培養(yǎng)Jurkat細胞的影響3.1細胞黏附試驗Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)24小時，先后計數懸浮的和總的Jurkat細胞，根據公式計算黏附率：(總細胞數-懸浮細胞數)/總細胞數×100％。A組

8、和B組細胞黏附率分別為28.8％±2.6％和57.4％±3.8％。抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1明顯降低Jurkat細胞黏附到骨髓基質細胞層(P＜0.05)。 3.2細胞增殖實驗Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)，在0、24、48、72和96小時分別以臺盼蘭拒染法計數Jurkat活細胞數，按照Patterson公式Td=Tlg2/lg(Nt/NO)計算倍增時間。A組Jurkat細胞倍增時間為約42小時，B組為約29小

9、時，表明抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細胞增殖變緩。 3.3細胞周期Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)3天，流式細胞術結果顯示，A組G0/G1、S和G2/M期Jurkat細胞比率分別為28.47％±2.39％、25.57％±1.90％和45.96％±3.24％，而B組分別為19.43％±2.80％、74.48％±3.23％和6.09％±1.96％。抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1使共培養(yǎng)

10、的Jurkat細胞G0/G1和G2/M期細胞增多，而S期細胞減少(P＜0.05)。 3.4細胞凋亡Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)3天，TUNEL結果顯示A組Jurkat細胞陽性率為15.2％±0.8％，而B組為5.4％±0.7％，抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細胞凋亡增多(P＜0.05)。 3.5PCNA,Bcl-2,Bax,Fas和FasL的表達Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)

11、3天，免疫細胞化學結果顯示A組Jurkat細胞PCNA陽性率為79.7％±2.6％，明顯低于B組的91.4％±2.9％(P＜0.05)。幾乎所有的Jurkat細胞表達Bcl-2、Bax、Fas和FasL，但兩組表達的陽性程度不同，IamgeProPlus軟件分析后用總陽性面積(μm2)×平均光密度/細胞數表示陽性程度。A組Jurkat細胞Bcl-2、Bax、Fas和FasL的陽性程度(×103/細胞)分別為82.5±6.0、166.3±

12、5.7、59.7±5.4和115.4±5.2，而B組分別為148.3±5.6、64.8±5.6、126.4±5.8和58.4±6.0。Bcl-2和Fas表達明顯減少而Bax和FasL明顯增多(P＜0.05)。 3.6藥物敏感性試驗Jurkat細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)1天再加入不同濃度(0，10，100，1000和10000nM)阿霉素共培養(yǎng)48小時，MTT法檢測Jurkat細胞存活率并計算50％抑制濃度(IC50)，A組IC50

13、為585nmol/L明顯低于B組6162nmol/L。表明抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細胞對阿霉素的藥物敏感性增強。 結論：急性白血病完全緩解1年內的骨髓基質細胞表達SDF-1高于正常，利用RNA干擾的方法可阻抑骨髓基質細胞表達SDF-1，抑制急性白血病骨髓基質細胞表達SDF-1可使共培養(yǎng)的Jurkat細胞黏附減少、增殖變緩、凋亡增多、對藥物阿霉素的敏感性增強。因此通過應用RNA干擾技術阻抑急性