酚類環(huán)境雌激素的色譜測(cè)定方法及其應(yīng)用研究.pdf

4、測(cè)定方法研究 建立了水產(chǎn)品中環(huán)境雌激素包括雙酚A(BPA)、4．壬基酚(4-NP)、4-叔辛基酚(4-tOP)、4-叔丁基酚(4-tBP)、四溴雙酚A(TBBPA)、已烯雌酚(DES)和內(nèi)源性雌激素雌二醇(17a-E2、17B-E2)的柱前熒光衍生-高效液相色譜測(cè)定方法。水產(chǎn)品樣品經(jīng)甲醇勻漿，超聲提取，冷凍過(guò)濾，鹽酸 (6mol／L)水解后，再用C18小柱富集、凈化。在無(wú)水條件下，被測(cè)化合物與衍生劑4-(4，5-diphenyl一1

5、H-imidazol-2-yl)benzoyl chloride(DIB-Cl)反應(yīng)后，用高效液相色譜一熒光檢測(cè)器檢測(cè)。對(duì)色譜柱的選擇、流動(dòng)相組成和比例、流速和熒光檢測(cè)波長(zhǎng)等進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳分析條件。采用波長(zhǎng)切換將過(guò)量的衍生試劑峰除去。最后用GC-MS方法對(duì)HPLC方法測(cè)定結(jié)果作進(jìn)一步確認(rèn)。 3.非水毛細(xì)管電泳一化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品包裝材料中酚類環(huán)境雌激素 食品包裝材料樣品浸泡液中的雙酚A、烷基酚等環(huán)境雌激素經(jīng)DIB-C

6、l衍生后，經(jīng)過(guò)非水毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離后，分別與過(guò)氧草酸酯化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系作用，光電信號(hào)經(jīng)過(guò)光電倍增管接收放大后被檢測(cè)。以17B-雌二醇為內(nèi)標(biāo)，以相對(duì)遷移時(shí)間(DIB-X遷移時(shí)間/DIB-內(nèi)標(biāo)遷移時(shí)間)定性，DIB-×相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度／DIB-內(nèi)標(biāo)物相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的比值(相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度比)定量，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品浸泡液中待測(cè)物的含量。(X代表待測(cè)的酚類環(huán)境雌激素) 結(jié)果： 1．對(duì)大鼠血清、組織樣品預(yù)處理和高效液相色譜測(cè)定BPA

7、、4-NP的條件進(jìn)行了優(yōu)化，BPA和4-NP分別在0.01-500.μg／ml和0.15～150.0μg/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。血清和組織樣品中BPA的檢出限(S/N=3)分別為2.8ng／ml和1.4ng／g，4.NP的檢出限分別為5.6ng/ml和2.8 ng／g。日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0％～11.4％，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1％～3.0％。BPA的加標(biāo)回收率為78.6％～95.0％，4-NP為80.2％～9

8、3.4％。將所建立的方法應(yīng)用于BPA和4-NP的毒代動(dòng)力學(xué)研究，獲得了單獨(dú)和聯(lián)合4-NP灌胃大鼠時(shí)，血清、組織中BPA的濃度-時(shí)間曲線以及相應(yīng)的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)BPA與4-NP聯(lián)合灌胃時(shí)，除了峰濃度(Cmax)和平均滯留時(shí)間(MRT)外，睪丸組織中BPA的其余動(dòng)力學(xué)參數(shù)均有顯著的變化(p<0.05，t>2.776)，而在血清、肝臟組織中沒(méi)有顯著性改變。另一方面，當(dāng)與BPA同時(shí)灌胃，4-NP的動(dòng)力學(xué)沒(méi)有發(fā)生顯著

9、性變化。各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)血清、組織中BPA和／或4-NP的濃度順序?yàn)椋焊闻K>血清>睪丸，這表明進(jìn)入到大鼠體內(nèi)的BPA和4-NP主要分布在肝臟中，其次在血清中；一小部分的BPA或／和4-NP能進(jìn)入睪丸，提示BPA和4-NP能通過(guò)睪丸屏障?？紤]到BPA或／和4-NP對(duì)雄性生殖系統(tǒng)可能的危害，研究隨食物攝入的BPA或，和4-NP對(duì)人類健康的危害具有重要意義。 2．對(duì)8種環(huán)境雌激素的衍生條件和水產(chǎn)品(魚(yú)、蝦、蟹等)樣品的處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化

10、。17B-E2、17a-E2、4-tBP、BPA、4-tOP,4-NP、DES和TBBPA在2.8ng／ml～10．0μg／ml范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。檢出限(S／N=3)為0.028ng／g～0.095ng／g。日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．55％～8.15％，加標(biāo)回收率為75.2％～95.5％。測(cè)定了10種水產(chǎn)品樣品，其結(jié)果與GC-MS方法相比，配對(duì)f檢驗(yàn)的P值均>0.5，即不能認(rèn)為兩法測(cè)定的結(jié)果有顯著性差異。

11、 3．對(duì)影響酚類環(huán)境激素非水毛細(xì)管電泳分離的主要因素(包括溶劑組成和比例，電解質(zhì)濃度、溫度、乙酸濃度、電泳電壓等)進(jìn)行了條件優(yōu)化。同時(shí)優(yōu)化了化學(xué)發(fā)光體系。4-tBP、BPA、4-OP、4-NP和TBBPA 5種環(huán)境雌激素在8.5ng/ml～3.0μg/ml范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。相對(duì)遷移時(shí)間(DIB-X遷移時(shí)間／內(nèi)標(biāo)遷移時(shí)間)和相對(duì)峰高的RSD分別在0.88％～2.96％和6.54％～8.57％間。加標(biāo)回收率在8

12、6.7％～98.8％范圍內(nèi)。對(duì)5種常見(jiàn)的食品包裝材料樣品進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)與第二部分建立的HPLC方法進(jìn)行比較，相對(duì)偏差為-10.8％-9.93％。 結(jié)論： 1．建立了超聲波提取，C18小柱凈化，HPLC-直接熒光同時(shí)測(cè)定大鼠血清、組織中的BPA和4-NP的方法。該方法具有簡(jiǎn)便、靈敏，準(zhǔn)確等特點(diǎn)。并將本方法成功地應(yīng)用于BPA和4-NP的毒代動(dòng)力學(xué)交互作用研究，目前在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)于研究環(huán)境激素的毒理作用和靶器官具有重要

13、意義，并且為評(píng)價(jià)環(huán)境、飲食暴露BPA和4-NP對(duì)人類造成的健康影響提供了可靠的方法研究和分析手段。 2．首次采用具有高熒光效率、反應(yīng)副產(chǎn)物較少的DIB-C1熒光衍生試劑同時(shí)柱前衍生8種環(huán)境雌激素(包括化工原料，內(nèi)源性雌激素和人工合成藥物)，并成功應(yīng)用于水產(chǎn)品類食品中8種環(huán)境雌激素的同時(shí)測(cè)定，獲得了滿意的結(jié)果。本方法簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、能滿足動(dòng)物性食品分析的要求。本研究還采用GC-MS方法對(duì)待測(cè)物作進(jìn)一步確認(rèn)，與本文建立的方法測(cè)定結(jié)果

14、進(jìn)行了比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不能認(rèn)為兩法的測(cè)定結(jié)果有顯著性差別。本研究可以為調(diào)查酚類環(huán)境雌激素污染狀況及研究食品中環(huán)境雌激素污染和人體健康的關(guān)系提供可靠的分析手段，對(duì)于保障食品安全，保護(hù)人民健康有重要的意義，也可為進(jìn)一步確認(rèn)環(huán)境雌激素暴露水平與有關(guān)疾病的相關(guān)關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。 3．本文首次建立了非水毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)食品包裝材料中酚類環(huán)境雌激素的方法。所建立的方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏。本研究為調(diào)查我國(guó)食品包裝材料中環(huán)境雌激素污