中藥清毒栓對(duì)HPV相關(guān)宮頸癌防治的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 通過研究中藥清毒栓含藥血清對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響以及其對(duì)MDM2基因和p53基因表達(dá)的影響，從細(xì)胞及分子生物學(xué)水平探討清毒栓防治宮頸癌的作用機(jī)制。 方法 1．含藥血清的提?。簠⒄绽顑x奎法提取含藥血清，56℃水浴滅活后分裝，-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?2．體外生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)：以不同濃度含藥血清培養(yǎng)液分別作用于SiHa細(xì)胞24、48、72、96h，并設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對(duì)

2、照藥血清為對(duì)照組，通過MTT法檢測(cè)該藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響，計(jì)算抑制率并選出最佳量效時(shí)點(diǎn)以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)； 3．細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：用流式細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期及細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)，根據(jù)MTT的最佳量效時(shí)點(diǎn)條件的藥血清培養(yǎng)液處理SiHa細(xì)胞后，用RNAase消化半小時(shí)，PⅠ避光染色1小時(shí)，上機(jī)檢測(cè)，Modi Fit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析并繪制DNA分布圖，同時(shí)設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對(duì)照藥血清為對(duì)照組； 4．用PT—

3、PCR法半定量檢測(cè)對(duì)原癌基因MDM2及抑癌基因p53mRNA表達(dá)的影響：根據(jù)MTT的最佳量效時(shí)點(diǎn)條件的含藥血清培養(yǎng)液處理SiHa細(xì)胞后，提取總RNA，進(jìn)行RT—PCR反應(yīng)后，電泳、凝膠圖像分析儀采集圖像，分析灰度值，同時(shí)設(shè)立空白血清及含中、西藥陽性對(duì)照藥血清為對(duì)照組。 結(jié)果: 1．清毒栓含藥血清對(duì)SiHa細(xì)胞體外增殖有明顯的抑制作用，并隨著血清濃度的增加其抑制作用更加明顯，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性?？诜M清毒栓含藥血

4、清與其它對(duì)照組相比72h時(shí)對(duì)SiHa細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，96h抑制作用明顯減弱，陰道給藥組各含藥血清組與空白血清對(duì)照組比較對(duì)細(xì)胞也有明顯的抑制作用。 2．細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的研究： 2.1 細(xì)胞周期各時(shí)相中，口服給藥各含藥血清組(G<,0>-G<,1>期所占比例較空白血清對(duì)照組增加，其差異有顯著性(P<0.01)。而口服各組含藥血清組S期所占比例較空白血清對(duì)照組減少，其差異有顯著性(P<0.05)，尤以干擾素組明顯(P<0

5、.01)，清毒栓組次之。而陰道給藥各含藥血清組與空白血清對(duì)照組比較在G<,0>-G<,1>期所占比例有增加的趨勢(shì)； 2.2 口服給藥組清毒栓組及干擾素組含藥血清對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，與空白血清對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；保婦康組含藥血清未見明顯差異，陰道給藥各含藥血清組與空白血清對(duì)照組比較在細(xì)胞凋亡方面未見明顯差異。 3．MDM2-p53基因反饋環(huán)表達(dá)： 3.1 對(duì)MDM2基因表達(dá)的影響：經(jīng)RT—PC

6、R并測(cè)定電泳條帶吸光度值，計(jì)算MDM2與β<,2m>基因擴(kuò)增片段的吸光度比值，可見各組含藥血清與空白對(duì)照組相比，MDM2mRNA的表達(dá)量降低(P<0.01)，以干擾素組最佳，清毒栓次之，清毒栓與干擾素組相比較無顯著性差異。 3.2 對(duì)p53基因表達(dá)的影響：經(jīng)RT—PCR并測(cè)定電泳條帶吸光度值，計(jì)算p53與β<,2m>基因擴(kuò)增片段的吸光度比值，可見各組含藥血清與空白對(duì)照組相比，p53 mRNA的表達(dá)量增加(P<0.01)，以干擾素