剛地弓形蟲(chóng)棒狀體ROP18基因的克隆、表達(dá)及ROP18蛋白抗感染免疫保護(hù)力的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，廣泛寄生于人體及動(dòng)物的組織細(xì)胞內(nèi)，引起人獸共患病。據(jù)美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的流行病學(xué)家調(diào)查研究估計(jì)，人類(lèi)每四個(gè)人中就有一人感染弓形蟲(chóng)，但通常只有免疫功能低的人才會(huì)因?yàn)楦腥竟蜗x(chóng)而表現(xiàn)出臨床癥狀。免疫系統(tǒng)正常的人也有可能因此患上嚴(yán)重的眼部疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，女性可造成所懷胎兒的先天性缺陷或死亡。
　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，弓形蟲(chóng)疫苗

2、從最早的全蟲(chóng)疫苗到新近迅速發(fā)展起來(lái)的核酸疫苗均取得了很大進(jìn)展。但是弓形蟲(chóng)滅活疫苗免疫保護(hù)力低，減毒活疫苗有恢復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)，不能用于人體，而基因工程多肽疫苗的制備費(fèi)用高、抗原性弱、制備過(guò)程復(fù)雜，因此，研制一款安全、有效的抗弓形蟲(chóng)疫苗對(duì)于保護(hù)易感人群以及促進(jìn)人類(lèi)優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。
　　弓形蟲(chóng)的頂端復(fù)合體在蟲(chóng)體侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中起著重要的作用，其中對(duì)棒狀體的研究較為廣泛、深入。作為棒狀體蛋白家族成員之一的ROP18被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的

3、最有可能與弓形蟲(chóng)入侵人體并在宿主細(xì)胞內(nèi)存活、大量繁殖有關(guān)的影響因子。因此，本文以剛地弓形蟲(chóng)RH株棒狀體蛋白R(shí)OP18為研究對(duì)象，探討其是否具有抗原性及免疫保護(hù)作用。
　　首先提取剛地弓形蟲(chóng)RH株基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增棒狀體蛋白18（TgROP18）基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接到原核表達(dá)載體pET30a(+)，建立重組表達(dá)載體pET30a(+)-TgROP18，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coli BL21(DE3)，陽(yáng)性菌落

4、加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG)分析重組蛋白TgROP18的表達(dá)情況，同時(shí)以鼠抗弓形蟲(chóng)血清為一抗，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析該重組蛋白的免疫反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增獲得TgROP18基因，長(zhǎng)約1665 bp，編碼554個(gè)氨基酸，其中前47個(gè)氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽序列。菌落PCR、雙酶切和測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒ET30a(+)-TgRO

5、P18構(gòu)建成功。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可獲得相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為59800的可溶性重組蛋白TgROP18。最終經(jīng)Western blotting分析，該重組蛋白可被鼠抗剛地弓形蟲(chóng)的血清識(shí)別。
　　確定融合蛋白His-ROP18成功表達(dá)后，誘導(dǎo)小鼠抗攻擊感染實(shí)驗(yàn)。將60只5～6周齡的雌性Balb/c小鼠，體重(18～20)g左右，隨機(jī)分成4組，每組15只。分別接種His-TgROP18-FCA(A組)、His-T

6、gROP18(B組）、弗氏完全佐劑(freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA)（C組）和PBS(D組)。經(jīng)腹腔注射，免疫劑量50μg/只，時(shí)間順序?yàn)?d-20d-34d。每次免疫前尾部靜脈采血，收集血清進(jìn)行細(xì)胞因子水平測(cè)定。最后一次免疫后1周，對(duì)所有小鼠經(jīng)腹腔注射感染含弓形蟲(chóng)速殖子103-5個(gè)/只，通過(guò)觀察小鼠生存率及免疫前后細(xì)胞因子白介素17(interleukin-17，IL-17)、γ干擾素(interfero

7、n-γ，IFN-γ)、白介素10(interleukin-10，IL-10)和白介素4(interleukin-4，IL-4)水平的變化分析弓形蟲(chóng)RH株ROP18蛋白的作用及機(jī)制。結(jié)果A組小鼠IL-4濃度均值54.17 ng·L-1，IL-10濃度均值106.88 ng·L-1，IL-17濃度均值5.02 ng·L-1，INF-γ濃度均值166.96ng·L-1;B組小鼠IL-4濃度均值52.56 ng·L-1，IL-10濃度均值103

8、.34ng·L-1，IL-17濃度均值4.99 ng·L-1，INF-γ濃度均值142.42 ng·L-1;C組小鼠IL-4濃度均值73.06 ng·L-1，IL-10濃度均值144.40 ng·L-1，IL-17濃度均值13.34 ng·L-1、，INF-γ濃度均值73.64 ng·L-1;D組小鼠IL-4濃度均值68.29 ng·L-1，IL-10濃度均值145.29 ng·L-1，IL-17濃度均值14.97ng·L-1，INF-

9、γ濃度均值76.50 ng·L-1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件單因素分析可知免疫后小鼠與對(duì)照組(B、C)相比，實(shí)驗(yàn)組(A、B)小鼠細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯升高(P＜0.05)，而IL-10、IL-4、IL-17水平有所降低(P＜0.05)，這些表現(xiàn)均符合各項(xiàng)細(xì)胞因子的生物學(xué)特點(diǎn)。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠中位生存期時(shí)間6～7 d相比，其中位生存時(shí)間延長(zhǎng)至22～25 d。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了:1.本實(shí)驗(yàn)室成功克隆TgROP18基因，