弓形蟲棒狀體蛋白38的序列變異及免疫保護作用研究.pdf

1、弓形蟲自從1908年被發(fā)現(xiàn)以來，人們對弓形蟲和弓形蟲病的認識經(jīng)歷了一個多世紀的發(fā)展變遷。現(xiàn)為人們熟知的是弓形蟲病可以通過母嬰傳播，經(jīng)口傳播，血液傳播等。因其宿主的廣泛性（幾乎所有的溫血動物）和傳播途徑的多樣化，全球有三分之一的人感染弓形蟲病，且每年呈增長趨勢。雖然大多數(shù)免疫功能正常的人為隱形感染，但是到目前為止，仍然沒有藥物可以根治弓形蟲病。臨床上治療弓形蟲病主要依賴一些磺胺類的化學藥物，而這些化學藥物只針對弓形蟲速殖子發(fā)揮作用，對弓形

2、蟲慢性感染沒有很好的療效。因此，抗弓形蟲病疫苗的研究已成為弓形蟲病研究的熱點問題。弓形蟲疫苗的研究經(jīng)歷了一個漫長的過程，從全蟲疫苗到蟲體特異組分疫苗階段，到基因工程疫苗再到現(xiàn)在的DNA疫苗階段。DNA疫苗的候選抗原分子多為與弓形蟲毒力、入侵相關的一些因子，包括微線體、棒狀體和致密顆粒等弓形蟲亞細胞器分泌的抗原分子。弓形蟲棒狀體蛋白38（rhoptry protein38，TgROP38）可以調節(jié)MAPK信號轉導途徑，在不同基因型的弓形蟲

3、蟲株中的表達量差異很大，而且在弓形蟲由速殖子向緩殖子轉換過程中，大多數(shù)棒狀體蛋白的表達量下調，而ROP38的表達量反而上調了5倍。本論文對弓形蟲ROP38基因的序列變異、蛋白特性和疫苗免疫保護作用進行了研究。
　　本論文首先對不同宿主和地理來源的13個弓形蟲蟲株的ROP38基因進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增、克隆和測序。13個蟲株ROP38片段長度為2646bp-2650bp，種內變異率為0.2-1.1％。用貝葉斯（Bayesi

4、an inference，BI）進行的種系發(fā)育分析顯示，基于ROP38基因重構的種系發(fā)育樹結果不能較好地顯示弓形蟲不同基因型蟲株之間的遺傳變異關系。
　　其次應用生物信息學軟件，預測了ROP38蛋白的生物學特性。以弓形蟲RH株基因組DNA為模板，應用PCR擴增出TgROP38基因的ORF序列。測序后，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并利用生物信息學軟件進行分析。結果表明TgROP38蛋白是跨膜蛋白，含有多個親水區(qū)域和B細胞抗原表位。<

5、br>　　本研究還評價了ROP38核酸疫苗的免疫保護作用。首先構建pVAX-ROP38真核表達質粒，成功轉染和表達于真核細胞HEK293。經(jīng)DNA免疫昆明系小白鼠，同時設立pVAX I、PBS和空白三個對照組。經(jīng)過3次免疫后，測定相應的體液免疫和細胞免疫指標。于三免后第14d，分別用弓形蟲強毒RH株速殖子致死劑量（1000個速殖子）腹腔感染小鼠，用弓形蟲弱毒Prugniaud（PRU）蟲株10個包囊灌胃感染小鼠，觀察其存活時間和包囊減少

6、率。結果顯示，構建的真核表達質粒 pVAX-ROP38免疫昆明小鼠后，可產生高水平IgG抗體水平和IL-2和IFN-γ，有效地誘導Th1型免疫應答，產生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8- T淋巴細胞。RH株攻擊感染實驗顯示，與7d內死亡的三個對照組相比，免疫組不能顯著延長小鼠存活時間（pVAX-ROP38，8.1d±0.75）。但與三個對照組相比，經(jīng)pVAX-ROP38免疫后，小鼠的腦包囊減少率為76.6%，差異

7、明顯。
　　本研究最后評價了rROP38和rROP18混合蛋白疫苗的免疫保護作用以及聚D,L-乳酸-co-乙醇酸（PLG）緩釋顆粒的免疫增強效應。構建了PLG-rROP38和PLG-rROP18的緩釋顆粒。用rROP38、PLG-rROP38、rROP18、PLG-rROP18、rROP38-rROP18和PLG-rROP38- rROP18免疫昆明小鼠，同時設立PBS、PLG-PBS和空白對照3個對照組。蛋白疫苗免疫后，測定小鼠

8、體內相應的體液免疫和細胞免疫指標，并于二免后6w，用PRU蟲株10個包囊灌胃感染小鼠，觀察其包囊減少率。實驗結果顯示，rROP38和rROP18緩釋顆粒的蛋白疫苗免疫昆明小鼠后，可產生高水平抗體及抗體亞類水平、IFN-γ和 IL-2含量，可有效地誘導 Th1-Th2混合型細胞免疫應答，產生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8- T淋巴細胞增殖。與對照組相比，rROP38和rROP18緩釋顆?；旌弦呙缃M的包囊減少率高達