剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達載體的構建及核酸疫苗免疫保護作用的研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性有核細胞內寄生原蟲，能感染所有的恒溫動物，據(jù)估計1/3的人口感染過弓形蟲。因其能導致視網(wǎng)膜瘢痕，腦損傷和孕婦流產后感染而成為引起人類疾病的一個主要原生物。弓形蟲棒狀體蛋白由其分泌器官棒狀體分泌，在蟲體入侵宿主細胞時具有重要的作用，尤其是與納蟲空泡的形成和修飾過程密切相關。本課題構建了剛地弓形蟲RH株ROP11基因的真核表達重組質粒pcDNA3.1(+)-ROP11，將重組質粒轉染

2、HeLa細胞，間接免疫熒光法檢測細胞內蛋白表達情況；將重組質粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，檢測小鼠血清IgG，細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并記錄弓形蟲感染小鼠后的存活時間評價其免疫保護力，以期為進一步研究弓形蟲ROP11基因核酸疫苗提供理論和物質基礎。
　　首先提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)TgROP11基因全長編碼序列（登錄號為 DQ077905）的開放閱讀框設計引物并進行逆轉錄PCR（RT-P

3、CR）擴增，將擴增的目的片段ROP11基因克隆至真核表達質粒 pcDNA3.1(+)上，構建重組表達質粒 pcDNA3.1(+)-ROP11，之后將PCR產物經EcoR I和Not I酶切后與同樣經EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表達載體連接，對重組質粒做菌落 PCR、EcoR I和Not I雙酶切和測序鑒定。結果顯示，RT-PCR擴增產物約為1548 bp，菌落 PCR及雙酶切結果正確，序列測序結果與GenBa

4、nk上報告的ROP11序列相比，8個核苷酸存在變異，導致5個氨基酸發(fā)生改變，其中在第56個氨基酸位置多了一個天冬酰胺。證明成功構建了弓形蟲ROP11的真核表達質粒pcDNA3.1(+)-ROP11。
　　確定表達質粒成功構建后，將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質粒轉化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli）XL-Blue內，篩選陽性克隆后擴大培養(yǎng)，提取質粒，之后通過 Lipofector陽離子脂質體轉染試劑將pcDNA3

5、.1(+)-ROP11重組質粒轉染至HeLa細胞內。間接免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)重組質粒轉染的HeLa細胞胞漿觀察到黃綠色熒光，對照組無熒光，證明了構建的真核表達質粒能夠在體外真核細胞內表達目的蛋白。
　　最后堿裂解法大量提取質粒，免疫小鼠。將40只8周齡BALB/C小鼠隨機分為4組，每組10只：實驗組、空質粒對照組、PBS對照組和空白對照組，每組均通過股四頭肌注射免疫小鼠，其中實驗組注射pcDNA3.1(+)-ROP11重組質粒為10

6、0μg(1μg/μl)，空質粒對照組注射pcDNA3.1(+)質粒為100μg(1μg/μl)，PBS對照組注射無菌PBS緩沖液為100μl，空白對照組不注射，共免疫3次，每次間隔2周，末次接種量均加倍。分別于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清檢測抗體和細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各組小鼠腹腔攻擊感染 RH株弓形蟲速殖子1×103個/只，觀察其存活時間及免疫保護力。小鼠免疫接種后，實驗組小鼠

7、血清抗體 IgG隨著免疫次數(shù)的增加而明顯增高，但空質粒對照組、PBS對照組和空白對照組相應的血清中均未出現(xiàn)明顯升高，末次注射后實驗組小鼠血清 IgG與空質粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗組小鼠IFN-γ濃度均值為364.51 pg/ml，較空質粒對照組（49.55 pg/ml）、PBS對照組（46.24 pg/ml）、空白對照組（47.52 pg/ml）比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；實驗組小

8、鼠IL-2濃度均值為151.54 pg/ml，較空質粒對照組（49.40 pg/ml）、PBS對照組（43.34 pg/ml）、空白對照組（43.23 pg/ml）比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；實驗組小鼠 IL-4濃度均值為131.45 pg/ml，較空質粒對照組（50.28 pg/ml）、PBS對照組（53.17 pg/ml）、空白對照組（49.14 pg/ml）比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；實驗組小鼠IL-10濃度均值為15

9、9.82 pg/ml較空質粒對照組（56.58 pg/ml）、PBS對照組（52.18 pg/ml）、空白對照組（49.29 pg/ml）比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。結果顯示，實驗組 IgG抗體水平和細胞因子水平明顯升高，與空質粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。后經抗感染免疫攻擊實驗發(fā)現(xiàn)實驗組、空質粒組、PBS組和空白對照組小鼠平均存活時間為236.3 h、97.8 h、96.3 h、96.2 h