剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及核酸疫苗免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能感染所有的恒溫動物，據(jù)估計1/3的人口感染過弓形蟲。因其能導(dǎo)致視網(wǎng)膜瘢痕，腦損傷和孕婦流產(chǎn)后感染而成為引起人類疾病的一個主要原生物。弓形蟲棒狀體蛋白由其分泌器官棒狀體分泌，在蟲體入侵宿主細(xì)胞時具有重要的作用，尤其是與納蟲空泡的形成和修飾過程密切相關(guān)。本課題構(gòu)建了剛地弓形蟲RH株ROP11基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

2、HeLa細(xì)胞，間接免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況；將重組質(zhì)粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，檢測小鼠血清IgG，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并記錄弓形蟲感染小鼠后的存活時間評價其免疫保護(hù)力，以期為進(jìn)一步研究弓形蟲ROP11基因核酸疫苗提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　首先提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)TgROP11基因全長編碼序列（登錄號為 DQ077905）的開放閱讀框設(shè)計引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-P

3、CR）擴增，將擴增的目的片段ROP11基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-ROP11，之后將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Not I酶切后與同樣經(jīng)EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體連接，對重組質(zhì)粒做菌落 PCR、EcoR I和Not I雙酶切和測序鑒定。結(jié)果顯示，RT-PCR擴增產(chǎn)物約為1548 bp，菌落 PCR及雙酶切結(jié)果正確，序列測序結(jié)果與GenBa

4、nk上報告的ROP11序列相比，8個核苷酸存在變異，導(dǎo)致5個氨基酸發(fā)生改變，其中在第56個氨基酸位置多了一個天冬酰胺。證明成功構(gòu)建了弓形蟲ROP11的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11。
　　確定表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建后，將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli）XL-Blue內(nèi)，篩選陽性克隆后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后通過 Lipofector陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3

5、.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)。間接免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞胞漿觀察到黃綠色熒光，對照組無熒光，證明了構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在體外真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白。
　　最后堿裂解法大量提取質(zhì)粒，免疫小鼠。將40只8周齡BALB/C小鼠隨機分為4組，每組10只：實驗組、空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組，每組均通過股四頭肌注射免疫小鼠，其中實驗組注射pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒為10

6、0μg(1μg/μl)，空質(zhì)粒對照組注射pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為100μg(1μg/μl)，PBS對照組注射無菌PBS緩沖液為100μl，空白對照組不注射，共免疫3次，每次間隔2周，末次接種量均加倍。分別于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清檢測抗體和細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各組小鼠腹腔攻擊感染 RH株弓形蟲速殖子1×103個/只，觀察其存活時間及免疫保護(hù)力。小鼠免疫接種后，實驗組小鼠

7、血清抗體 IgG隨著免疫次數(shù)的增加而明顯增高，但空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組相應(yīng)的血清中均未出現(xiàn)明顯升高，末次注射后實驗組小鼠血清 IgG與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組小鼠IFN-γ濃度均值為364.51 pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（49.55 pg/ml）、PBS對照組（46.24 pg/ml）、空白對照組（47.52 pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；實驗組小

8、鼠IL-2濃度均值為151.54 pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（49.40 pg/ml）、PBS對照組（43.34 pg/ml）、空白對照組（43.23 pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；實驗組小鼠 IL-4濃度均值為131.45 pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（50.28 pg/ml）、PBS對照組（53.17 pg/ml）、空白對照組（49.14 pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；實驗組小鼠IL-10濃度均值為15

9、9.82 pg/ml較空質(zhì)粒對照組（56.58 pg/ml）、PBS對照組（52.18 pg/ml）、空白對照組（49.29 pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)果顯示，實驗組 IgG抗體水平和細(xì)胞因子水平明顯升高，與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實驗發(fā)現(xiàn)實驗組、空質(zhì)粒組、PBS組和空白對照組小鼠平均存活時間為236.3 h、97.8 h、96.3 h、96.2 h