剛地弓形蟲RH株ROP10基因真核表達載體的構(gòu)建及其免疫原性分析.pdf

1、目的:弓形蟲（Toxoplasma gondii）是世界性分布的寄生蟲。該蟲是重要的機會性致病原蟲，寄生于人體及動物的有核細胞內(nèi)，可感染人體和全球200多種動物，引起弓形蟲病。據(jù)估計全世界30％的人群感染本蟲。免疫功能低下和新生兒是弓形蟲病的最大受害者，可引起嚴重的后果，直接影響到人類的健康和社會的發(fā)展，同時對食品公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)也造成了一定程度的隱患和危害，而目前尚沒有理想的防治弓形蟲病的藥物，所以研制安全有效的疫苗預防該病尤為重

2、要。研究表明弓形蟲棒狀體蛋白由棒狀體分泌，對弓形蟲侵入宿主細胞并對其發(fā)揮毒力方面均起著重要的作用，在疫苗研制方面具有很大的潛力。本研究通過分子生物學方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-ROP10，并將其肌肉注射免疫BALB/c小鼠，為進一步研究弓形蟲ROP10基因核酸疫苗提供實驗基礎。
　　方法:提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)已發(fā)表的ROP10基因序列（登錄號為DQ124368）設計引物并進行ROP10基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-P

3、CR)擴增，將擴增的目的片段ROP10基因克隆至真核表達質(zhì)粒pVAX1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ROP10，并通過菌落PCR、酶切分析、基因測序的方法對重組質(zhì)粒進行鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌(E.coli) XL1-Blue內(nèi)，篩選陽性克隆后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后通過lipofectamine陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pVAX1-ROP10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細胞內(nèi)，提取HeLa細胞的總RNA，分別進行β-acti

4、ng基因和ROP10基因的RT-PCR擴增，其RT-PCR擴增產(chǎn)物用電泳驗證以檢驗ROP10基因是否在HeLa細胞內(nèi)表達。將重組質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫8周齡BALB/C小鼠，每隔兩周免疫一次，在每次注射免疫前和末次注射免疫后的第二周采集小鼠血清，采用間接ELISA法檢測血清中抗體IgG水平和細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）的水平，并觀察各組小鼠的存活時間。
　　結(jié)果:經(jīng)RT-PCR擴增ROP10基因產(chǎn)物為1

5、761bp，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ROP10，并經(jīng)菌落PCR、EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分析和基因測序得到證實。將重組質(zhì)粒pVAX1-ROP10轉(zhuǎn)染至HeLa細胞并提取總RNA后，β-actin基因和ROP10基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳驗證分別在613bp處和1761bp處有明亮條帶，與預期片段大小相符，證明了ROP10能夠在體外真核細胞內(nèi)表達。小鼠免疫接種后，實驗組小鼠血清中的IgG抗體隨著免疫次數(shù)的增加而有

6、明顯地升高，但空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組相應的血清中均未出現(xiàn)明顯升高。末次免疫后2周，實驗組小鼠血清中IgG抗體水平明顯升高，與其他對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。小鼠血清中IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的水平(pg/ml)，實驗組分別為465.31±12.21、168.52±11.22、150.35±11.34、166.00±12.34。空質(zhì)粒組分別為50.32±6.73、48.63±6.02、52.

7、00±6.83、53.67±5.94。PBS對照組分別為47.02±4.68、42.34±5.24、47.30±5.23、50.63±5.94。空白對照組分別為48.39±5.23、46.32±5.25、49.23±7.84、50.00±6.82。實驗組的細胞因子水平明顯升高，與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)?？垢腥久庖弑Ｗo實驗表明，與其它對照組比較，實驗組小鼠平均存活時間明顯延長(P＜0.05)