喉癌侵襲轉移相關的microRNA篩選及分子標簽建立.pdf

1、頭頸部鱗癌是第六位最常見惡性腫瘤，喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，在呼吸道腫瘤中發(fā)病率居第二位，以鱗狀細胞癌為主，約占95％。隨著工業(yè)化的發(fā)展和空氣污染的加重，喉癌在我國以及世界范圍內其發(fā)病率呈逐步上升趨勢。有調查表明，喉癌的發(fā)病率不斷升高，每年約增加25％。而且，根據(jù)最新的研究，雖然近30年來新的外科手術方法、化療藥物、更先進的放射治療手段以及靶向藥物已應用在喉癌的治療中，喉癌患者的總生存率不但并未得到提高，甚至有下降的趨勢，

2、僅約50％，晚期喉癌的生存率更低達30～40％?？傮w治療效果仍難令人滿意。
　　 一般認為，喉癌的不良預后通常與腫瘤晚期診斷、復發(fā)及轉移相關。目前關于喉癌預后不良的相關因素的研究結果差異較大，進一步了解影響喉癌術后生存和預后的密切相關因素，可為喉癌患者預后評估及個體化治療策略制定提供必要的依據(jù)。
　　 提高喉癌早期診斷率、復發(fā)傾向的早期預測及有效干預措施是進一步提高喉癌療效的關鍵。盡管隨著影像技術的進步以及高清內鏡的普及

3、使用，可為臨床醫(yī)生提供了早期診斷喉癌的手段，然而傳統(tǒng)的喉癌病理診斷方法等是從細胞水平反映腫瘤的生物學特征，具有局限性，不能充分反映腫瘤的真實本質。隨著分子醫(yī)學的進步，研究已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤在分子水平具有不同的表型，這種分子的變異譜與腫瘤的預后及療效預測相關。研究喉癌的分子機制并尋找特異的治療靶點是提高喉癌療效的關鍵。
　　 microRNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于多細胞生物中的小分子RNA，長度為

4、20-22個核苷酸，其本身不是編碼蛋白質，它們是在轉錄后水平起調節(jié)作用。microRNA在人類基因組中只占整個基因組基因總數(shù)的2％左右，但可能有超過30％的基因受miRNA調控，越來越多的研究顯示微小RNA變異譜可能在腫瘤生物學行為過程中起非常重要的作用。每個miRNA可以控制數(shù)百個基因的表達，在基因組的調控網(wǎng)絡中發(fā)揮著至關重要的作用。miRNAs調控腫瘤的生物學特性是可能作為抑癌基因，下調靶原癌基因的活性，也可作為促癌基因，下調靶抑癌

5、基因的活性。在不少疾病尤其明顯的是在腫瘤中，miRNA的表達譜具有一定的特征性改變。人們發(fā)現(xiàn)對不同腫瘤特定的miRNA水平進行分析，有助于腫瘤的早期診斷和預后評估。miRNAs的研究為探索喉癌的侵襲轉移機制、尋找新的診斷標記物和治療靶點提供了很有前景的研究方向。
　　 最新的研究方法及技術主要包括生物信息學方法和先進的基因芯片技術等實驗生物學方法為microRNA的研究提供了非常良好的手段。這些技術與方法已成功應用于多種腫瘤的研

6、究中并顯示出其顯著地優(yōu)越性。
　　 喉癌的microRNA研究處于起步階段，目前在喉癌miRNA的相關研究仍存在許多不足之處:多為頭頸鱗癌的研究，單純喉癌研究很少，結果差異較大。既往的研究提示我們，可利用基因芯片等先進高效的技術平臺篩選出喉癌復發(fā)轉移相關的microRNA及其靶基因作為分子靶標，以期建立喉癌早期復發(fā)轉移的臨床分子預測、監(jiān)測機制，及早干預，達到臨床防治喉癌復發(fā)、提高療效及改善患者預后的目的。本課題在規(guī)范化腫瘤標本收

7、集和保存的基礎上，采用基因芯片技術篩選分析與喉癌不良預后相關的microRNA及其靶基因并進行驗證，以期尋找出可能的生物標記物。研究主要分為以下幾部分。
　　 第一章喉癌規(guī)范化標本庫的建立與管理
　　 目的:建立規(guī)范化的喉癌標本庫，為喉癌的科學研究提供高質量的標本，并進行信息化管理。
　　 方法:采集并保存喉癌組織和血標本，定期提取部分標本總RNA進行質量鑒定，對病人進行隨訪，收集喉癌病人臨床病理信息、標本信息、

8、生存狀況、復發(fā)情況、術后喉功能等資料并通過電腦軟件進行信息化管理。
　　 結果:從建立喉癌標本庫至2012年12月，共成功收集147例配對的喉癌/癌旁正常組織標本和82例血漿及血清標本，質量鑒定顯示標本質量良好。建立并完善了標本的采集、處理、保存以及信息化管理的標準化流程。建立了喉癌病人全面、準確的信息庫，提高了標本管理和使用的效率和準確性。
　　 結論:喉癌規(guī)范化標本庫的建立對喉癌的研究具有重要的價值，有助于保護寶貴的

9、生物醫(yī)學資源。標準化的標本采集、處理保存、信息化管理為喉癌研究提供了高質量的標本，保證其順利進行發(fā)揮了關鍵作用。
　　 第二章喉鱗癌患者手術治療后的預后因素回顧性分析
　　 目的:探討影響喉鱗狀細胞癌患者術后生存和預后的最重要因素。
　　 方法:收集在廣東省人民醫(yī)院治療的205例接受喉全切除術、喉部分切除術或顯微喉鏡下CO2激光切除術的喉鱗狀細胞癌患者的臨床和隨訪資料，應用Kaplan-Meier法進行生存分析，

10、通過Cox比例風險模型對影響患者預后的因素進行多元回歸分析。
　　 結果:腫瘤分型中，69.8％的病例為聲門型和30.2％為聲門上型。多數(shù)患者為N0(77.6％)，22.4％的患者為N1-N3。超過半數(shù)患者為T1-T2期(55.1％)，20.0％為T3期，24.9％為T4期。中位隨訪時間為49.2個月。術后第1，2，3年的生存率分別為99.0％，91.7％和81.5％。Ⅳ期患者的生存率低于Ⅰ期和Ⅱ期者(分別為p＜0.001和p=

11、0.013)。術后第1，2，3年的無進展生存率分別為83.9％，74.6％和71.2％。而且，Charlson評分為1-2或≥3的患者相對Charlson評分為0者有更高的死亡率(HR分別為1.8和2.41，p=0.042和p=0.008)。多因素分析顯示臨床分期、外科切緣及同病與患者的死亡率和無疾病進展生存率顯著相關。
　　 結論:外科切緣、臨床分期及同病是影響喉癌患者預后的獨立因素，晚期、切緣陽性者、嚴重同病患者的生存率顯著

12、降低，提示了喉癌早診早治、獲得手術切緣陰性以及同病狀況對預后的重要性。
　　 第三章利用基因芯片技術檢測喉癌組織中差異表達的miRNAs
　　 目的:篩選并分析喉癌組織與周圍正常喉黏膜的微小RNA(micro-RNAs，miRNAs)之間的表達譜差異，為進一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供線索。
　　 方法:收集喉癌組織和癌旁正常喉黏膜標本共10對，應用Invitrogen公司的TRIzol和QIAGE

13、N公司的miRNeasy mini kit試劑盒抽提總RNA，使用nanodrop公司的分光光度計ND-1000測定RNA的質量和定量，RNA的完整性由凝膠電泳判定。使用丹麥Exiqon公司的miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit，進行miRNA標記。在熒光標記后進行雜交。用Axon GenePix4000B microarray scanner(Axon)進行掃描。掃描得到的圖像輸入GeneP

14、ix Pro6.0(Axon)軟件進行坐標調整和數(shù)據(jù)提取對喉癌中的miRNA差異表達進行篩選。根據(jù)差異表達的比值，閾值大于2倍以上為上調，小于0.5倍為下調。采用SAM軟件對數(shù)據(jù)進行校正。
　　 結果:通過miRNA芯片篩選，我們得到了2662個差異表達的miRNA，將其中的非人類miRNA以及超過一半樣本無法檢測到的miRNA去除后，發(fā)現(xiàn)了780個miRNA有差異表達，其中277個microRNA表達上調，503個microR

15、NA表達下調。我們對芯片分析結果獲得的780個miRNA進一步采用SAM軟件分析，設定FDR為0.05，經校正后在喉癌組織中共有11個miRNA表達顯著上調;114個miRNA表達顯著下調。
　　 結論:1.基因芯片技術篩選喉癌特征性microRNA表達譜是可行的。2.對芯片結果的分析需注意統(tǒng)計學的多種檢驗問題，因此應做錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正。3.基因芯片結果存在一定假陽性，需其他方法進一步驗證。
　　 第四章應用實時

16、熒光定量PCR(qRT-PCR)對基因芯片結果進行驗證
　　 目的:驗證基因芯片篩選結果的可靠性
　　 方法:從32例喉癌病人的腫瘤及癌旁正常組織用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，通過實時熒光定量PCR的方法，采用Sybr-Green染料法，以U6為內參基因，對于芯片結果中顯著下調的microRNA中選取let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、m

17、iRNA-195-5p、miRNA-203的表達量進行檢測。Bio-Rad CFX96 Manager軟件分析，GraphPad軟件作圖。
　　 結果:對let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個表達下調的miRNAs進行qRT-PCR驗證，這6個miRNA在32對喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達差異均有統(tǒng)計學意義其中m

18、iRNA-125a-5p、miRNA-144-3p和miRNA-203最顯著。
　　 結論:實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的結果與基因芯片結果一致，基因芯片結果是可靠的。
　　 第五章觀察篩選出的目標microRNA對喉癌Hep2細胞株增殖及轉移、侵襲的作用研究
　　 目的:選取了在芯片實驗中及qRT-PCR中已驗證的顯著下調的miR-144-3p在喉癌細胞株Hep-2進行體外實驗，觀察其對喉癌細胞的增殖、

19、侵襲和轉移能力的影響及尋找其可能的靶基因。
　　 方法:1.利用生物信息學查找出mir-144-3p的可能靶基因。2.應用細胞轉染技術，通過MTT實驗、克隆形成實驗及細胞周期檢測觀察miR-144-3p對喉癌細胞的增殖的影響。3.通過Transwell侵襲實驗、3D-Culture、劃痕實驗，觀察喉癌細胞侵襲轉移能力的變化。4.綜合運用了qRT-PCR、Westernblot技術、GFP報告基因、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究了喉癌

20、細胞中miR-144-3p對于可能靶基因的調控作用。
　　 結果:1.利用生物信息學查找出mir-144-3p的可能靶基因為ETS-1。2.miR-144-3p可使喉癌細胞增殖、侵襲和轉移能力減弱。3.miR-144-3p可使ETS-1表達下調。4.miR-144-3p可使上皮分子標志物(E-Cadherin，α-catenin)的表達升高，間質分子標志物（Fibronectin，Vimentin等）表達降低。
　　 結

21、論:1.miR-144-3p在喉癌組織中表達下調，提示了其在喉癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。2.miR-144-3p可能是通過作用于其下游的靶基因ETS-1對喉癌細胞的侵襲轉移起抑制作用，同時miR-144-3p有抑制喉癌細胞的增值的作用。3.miR-144-3p可能是通過上皮-間質轉化(EMT)影響喉癌Hep2細胞株侵襲轉移的。
　　 第六章ETS-1的表達與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展及預后的關系
　　 目的:觀察轉錄因子ETS-1

22、在喉鱗癌組織中的表達;探討其在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及與預后的關系和意義。
　　 方法:采集54例配對喉癌、癌旁正常組織及34例不典型增生石蠟組織標本，采用免疫組織化學分別檢測其ETS-1的表達，并對喉癌病人每三個月進行隨訪，至少隨訪三年，收集喉癌病人臨床病理信息、生存狀況等資料。另外采集8例配對新鮮冰凍喉癌、癌旁正常組織，采用qRT-PCR及Western blot進一步驗證ETS-1在喉癌中的表達變化。
　　 結果

23、:ETS-1在喉癌組織和不典型增生中呈表達陽性者均顯著高于癌旁正常組織(P＜0.001)。ETS-1的表達水平高低與臨床分期、T分期、甲狀軟骨受侵、病理分化顯著相關(P＜0.05)，而與性別、年齡、N分期、腫瘤分型無關(P＞0.05);ETS-1蛋白低表達的患者其總生存率要明顯高于ETS-1蛋白高表達患者。新鮮標本中的qRT-PCR及Western blot實驗結果進一步證實了ETS-1在喉鱗狀細胞癌中呈高表達。
　　 結論:E