胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)功能基因的研究.pdf

1、胃癌是全球最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居腫瘤的第四位和第二位。全世界每年約有90萬胃癌新發(fā)患者，同時約有70萬人死于胃癌。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均居第二位，明顯高于世界平均水平。多年來胃癌治療后的五年生存率一直低于24％。導致胃癌高死亡率的重要原因是胃癌經(jīng)常發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，治療后又易于復發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，尋找和研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子和功能性基因，從而獲得能用于靶向治療轉(zhuǎn)移性胃癌及胃癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子靶標的功能性基因。同時

2、也望能獲得檢測預示胃癌復發(fā)轉(zhuǎn)移及預后的分子標志物，為胃癌的臨床個體化治療提供科學依據(jù)。
　　 本研究針對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能，首先采用體外Matrigel侵襲克隆篩選技術(shù)，建立了體外高侵襲能力的胃癌亞細胞系SNU5-P3和PAMC82-P3。通過全基因組芯片比較SNU5-P3和PAMC82-P3與其親本細胞的基因表達譜，獲得了38個在兩張芯片共同上調(diào)表達的差異基因，其中16/38(42％)已報道是與侵襲轉(zhuǎn)移功能相關(guān)的基因。LO

3、XL2是一個在兩張芯片共同上調(diào)表達的基因，通過生物信息學分析和細胞表達譜分析，表明LOXL2可能是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的功能基因。WesternBlot檢測結(jié)果顯示LOXL2在6種高侵襲的胃癌細胞系中的表達明顯地高于侵襲能力弱的3種胃癌細胞系。在514例組織標本中，通過免疫組化檢測LOXL2的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在正常組織、胃癌組織以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的組化染色評分分別為0.43、1.47及1.87，提示LOXL2在正常組織、胃癌組織以及轉(zhuǎn)移淋

4、巴結(jié)逐級上調(diào)表達。此外分析發(fā)現(xiàn)LOXL2在胃癌原發(fā)灶的表達與胃癌的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預后不良密切相關(guān)(P<0.001)，通過COX多因素分析提示LOXL2是一個獨立于腫瘤侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有價值的預后因子。因此，我們較系統(tǒng)探討研究了該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能及其相應的分子機制。RNA干擾研究結(jié)果顯示該基因的靜默能夠在體外顯著抑制胃癌細胞PAMC82-P3和BGC823的侵襲能力分別達51.7％和53.5％，體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型研究顯示RN

5、A干擾該基因的表達對胃癌細胞的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有明顯的抑制作用，抑制率達90％。外源基因轉(zhuǎn)染低侵襲能力的胃癌細胞系N87后，轉(zhuǎn)染后的N87細胞在體外的侵襲能力增加約2.5倍。這些研究結(jié)果表明LOXL2基因在體內(nèi)外都能明顯地促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。體外利用LOXL2抗體及人重組蛋白處理胃癌細胞，首次發(fā)現(xiàn)分泌型的LOXL2能顯著促進腫瘤細胞的侵襲(P<0.01)、與基質(zhì)的粘附(P<0.01)，并且這種抑制作用具有劑量依賴關(guān)系。分子機制研究表明分泌

6、型的LOXL2能夠氧化細胞外底物產(chǎn)生過量的過氧化氫，進而激活Src-FAK信號通路來促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。針對分泌型的LOXL2，我們制備了LOXL2兔多抗，通過體內(nèi)抗體治療實驗發(fā)現(xiàn)，LOXL2抗體能夠有效地抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其對自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的抑制率高達99％，提示分泌型的LOXL2是一個治療胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的有潛力的分子靶標。這些關(guān)于LOXL2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能及其分子機制的研究，國內(nèi)外尚未見報道。
　　 尋找胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相

7、關(guān)基因及分子有利于篩選獲得能夠預示胃癌轉(zhuǎn)移、胃癌分期及預后的相關(guān)分子標志物，為臨床實現(xiàn)個體化治療胃癌及胃癌轉(zhuǎn)移提供重要的科學依據(jù)。我們針對上面38個在兩張侵襲芯片中共同上調(diào)表達的差異基因，通過表達譜分析和生物信息學分析選取了4個基因作預示胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的候選標志物。在238例具有完整預后臨床資料的胃癌標本中通過免疫組化檢測這四個基因的表達情況，結(jié)果顯示，S100A14和LGASL1的表達與胃癌病人的TNM分期以及預后不良密切相關(guān)(P<0.

8、01)。進一步分析發(fā)現(xiàn)S100A14和LGASL1的表達與pNO胃癌的預后密切相關(guān)(logranktest，P<0.01)。隨后通過邏輯回歸分析和leave-one-out檢測分析這些標志物預測胃癌pNO期病人術(shù)后5年是否死亡的敏感性和特異性。統(tǒng)計結(jié)果顯示，LGALS1單獨預測的敏感性是68.7％，特異性是78.9％:S100A14單獨預測的敏感性是79.7％，特異性是74.5％；此外，我們還發(fā)現(xiàn)T分期參數(shù)預測胃癌pNO期病人術(shù)后5年內(nèi)