缺氧時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元保護(hù)性相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié).pdf

1、缺氧是臨床常見病理現(xiàn)象，可導(dǎo)致多種缺氧性疾病，涉及呼吸、神經(jīng)、心血管等諸多領(lǐng)域。由于腦組織儲能少、耗氧量大，極易產(chǎn)生缺氧性損傷。因此，缺氧時(shí)的腦保護(hù)，是神經(jīng)學(xué)研究的重要課題。 腦組織缺氧后，其細(xì)胞內(nèi)ATP生成不足、酸中毒、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、膜電位改變等，使神經(jīng)遞質(zhì)合成減少及受體表達(dá)異常，這些功能蛋白的異常，影響了突觸傳遞，導(dǎo)致腦細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)改變。 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的遞質(zhì)系統(tǒng)。腦細(xì)胞維持正常功能有賴于其中興奮

2、性氨基酸和抑制性氨基酸相互平衡。前者以谷氨酸和天冬氨酸為代表，介導(dǎo)大部分快速興奮性突觸傳遞，后者以γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(glycine)為代表，介導(dǎo)大部分快速抑制性突觸傳遞。近來發(fā)現(xiàn)，抑制性氨基酸在保護(hù)腦細(xì)胞、抵抗缺氧/缺血和其它應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[1-2]，且抑制性氨基酸對不同發(fā)育期的神經(jīng)元有不同的作用[3]。然而，在缺氧環(huán)境中，不同年齡神經(jīng)元的GABA受體和glycine受體的表達(dá)情況以及抑制性氨基酸對這兩個(gè)受體表

3、達(dá)的影響還不很清楚。 腦內(nèi)另一重要的遞質(zhì)系統(tǒng)是乙酰膽堿系統(tǒng)，該系統(tǒng)參與了機(jī)體運(yùn)動(dòng)與感覺過程的信息傳遞。由于膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)是乙酰膽堿合成的限速酶，它的異常與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等疾病密切相關(guān)[4]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，缺氧影響了乙酰膽堿的代謝，參與了阿爾茨海默病的發(fā)生、發(fā)展，但缺氧究究影響了乙酰膽堿系統(tǒng)的哪些環(huán)節(jié)，還有待進(jìn)一步闡明。 本課題第一部分通過大鼠腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)并予缺氧處

4、理，在培養(yǎng)液中分別添加抑制性氨基酸γ-氨基丁酸、甘氨酸和?；撬徇M(jìn)行刺激，測定GABA受體(GABAARal)和glycine受體(GlyRal)密度，以研究抑制性氨基酸對這兩種受體的影響。 另外，文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，δ阿片受體(6-opioid receptor，DOR)對腦缺氧/缺血具有保護(hù)作用。本課題第二、第三部分借助于本實(shí)驗(yàn)室建立的DOR轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)缺氧處理后，觀察大腦皮層神經(jīng)元中GABA受體及ChAT表達(dá)的變化，探討缺

5、氧和轉(zhuǎn)基因DOR對GABA受體及ChAr的影響。 第一部分抑制性氨基酸對發(fā)育中缺氧性皮質(zhì)神經(jīng)元γ-氨基丁酸和甘氨酸受體表達(dá)影響的研究 目的：研究抑制性氨基酸對發(fā)育中缺氧性皮層神經(jīng)元γ-氨基丁酸和甘氨酸受體表達(dá)的影響。 方法：取妊娠17-18天的胚胎大鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)，給予1％氧進(jìn)行缺氧處理；在細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別用不同濃度(10-2000μM)的抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(glycine)和

6、?；撬?taurine)于體外培養(yǎng)的第4天(DIV4)和20天(DIV20)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行添加刺激；此外，分別在DIV4和DIV20時(shí)使用腦啡肽(DADLE，一種DOR激動(dòng)劑)刺激。用Western blot方法測定細(xì)胞中GABAARal和GlyRal蛋白密度。 結(jié)果：(1)在體外生長發(fā)育的皮層神經(jīng)元中，GABAARal和G1yRal的表達(dá)有變化，即在未發(fā)育成熟(DIV4)神經(jīng)元中，GABAARal表達(dá)較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，

7、表達(dá)逐漸增加；GlyRal表達(dá)在神經(jīng)元發(fā)育早期已達(dá)成熟期的較高水平。(2)缺氧提高了未成熟神經(jīng)元GABAARal和GlyRal的表達(dá)，而降低了GABAARal和GlyRal在成熟神經(jīng)元的表達(dá)。(3)常氧狀態(tài)下，GABA和glycine傾向于降低未成熟神經(jīng)元GABAARal和GlyRal表達(dá)，但促進(jìn)了發(fā)育成熟神經(jīng)元的表達(dá)。(4)缺氧時(shí)，GABA，glycine和taurine降低了GABAARal和GlyRal在未成熟神經(jīng)元中的表達(dá)，而對

8、成熟神經(jīng)元，則抵御了缺氧引起的受體表達(dá)下降。(5)δ阿片受體(δ-opioid receptor，DOR)的激活促進(jìn)了GABAARal和GlyRal在常氧狀態(tài)下成熟和未成熟神經(jīng)元以及缺氧狀態(tài)下成熟神經(jīng)元中的表達(dá)。 結(jié)論：抑制性氨基酸對未成熟神經(jīng)元由于其細(xì)胞毒性作用，降低了GABAARal和GlyRal在常氧和缺氧時(shí)的表達(dá)；而對成熟神經(jīng)元，防止了缺氧引起的受體表達(dá)下降，并在常氧時(shí)保護(hù)了皮層細(xì)胞，同時(shí)上調(diào)了GABAARal和GlyR

9、al表達(dá)；DOR有細(xì)胞保護(hù)作用，并提高了GABAARal和GlyRal表達(dá)。 第二部分慢性缺氧對DOR轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）影響的研究 目的：用轉(zhuǎn)基因增加DOR(δ-opioid receptor)表達(dá)的方式，研究慢性缺氧狀態(tài)下小鼠腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)的變化，了解DOR對膽堿能神經(jīng)元的作用。 方法：對成年(30日齡)和發(fā)育晚期(20日齡)之DOR轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠分別進(jìn)行1天、3天

10、、5天和7天缺氧(10％氧濃度)處理，取其皮層、皮層下、海馬、腦干和小腦5個(gè)部位腦組織，用Western blot方法測定ChAT水平。 結(jié)果：在常氧環(huán)境中，DOR轉(zhuǎn)基因鼠4個(gè)腦區(qū)(皮層、皮層下、海馬、腦干)中ChAT密度明顯低于野生型鼠；慢性缺氧(7天)使野生型鼠腦皮層、海馬和腦干內(nèi)ChAT密度降低，而同樣慢性缺氧后，DOR轉(zhuǎn)基因鼠上述腦區(qū)ChAT密度不但不下降，相反有增加趨勢。 結(jié)論：缺氧降低了野生型小鼠腦內(nèi)ChAT

11、表達(dá)水平。而在轉(zhuǎn)基因小鼠，由于DOR的高表達(dá)，防止了缺氧誘發(fā)的ChAT下降，提示DOR對缺氧狀態(tài)下的膽堿能神經(jīng)元具有保護(hù)作用。 第三部分缺氧對DOR轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮層神經(jīng)元GABAA受體表達(dá)影響的研究 目的：通過對DOR(δ-opioid receptor)轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在缺氧和常氧狀態(tài)下皮層神經(jīng)元中GABAA受體的研究，從整體動(dòng)物水平了解缺氧和轉(zhuǎn)基因 DOR對大腦皮層神經(jīng)元GABAA受體表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索DO

12、R的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：將DOR轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠分為缺氧組和常氧組(非缺氧組)，對缺氧組分別施以1天、3天、5天和7天缺氧(10％氧濃度)處理。取其大腦皮層組織，提取蛋白質(zhì)，用Western blot方法測定其GABAA受體(GABAARotl)水平。 結(jié)果：在常氧環(huán)境，DOR轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層中GABAARal密度傾向于較野生型鼠為低，慢性缺氧后這種差異更加明顯(P<0.05)；經(jīng)過1-7天的缺氧，野生型小鼠大