細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4單克隆抗體在荷人T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞裸鼠中作用的實驗研究.pdf

1、目的:已有國外文獻及我科前期實驗證明,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Tr)是一種免疫抑制性調(diào)節(jié)細(xì)胞,可以抑制機體識別自身腫瘤細(xì)胞的腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化,在介導(dǎo)腫瘤免疫耐受與腫瘤免疫逃逸中起重要作用,在初治非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL)患者外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例明顯升高,初治患者CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例較正常對照組CD4+C

2、D25+Tr細(xì)胞比例明顯升高,化療后完全緩解者(CR)及部分緩解者(PR)CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例與治療前均有顯著性差異。且初治NHL患者外周血CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例與患者年齡、性別、PS狀態(tài)、臨床分期、病理類型之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。通過上面的結(jié)果,可以認(rèn)為,CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例是一個較好的反映細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的參考指標(biāo)之一。如能阻斷CD4+CD25+Tr細(xì)胞活化、增殖的途徑,將打破機體對腫瘤細(xì)胞的耐受,從而引起

3、機體對腫瘤細(xì)胞的免疫作用,清除腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocytic associated antigen,CTLA-4)是活化T細(xì)胞表面表達的一種跨膜糖蛋白分子,與B7和CD28同屬免疫球蛋白超家族成員?，F(xiàn)代免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),初始T細(xì)胞的完全激活需要雙重信號的刺激,既需要T細(xì)胞上抗原受體(TCR)提供的抗原特異性信號,即T細(xì)胞上TCR和APC加工處理的抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合(第一信號)

4、,還必需有抗原非特異性共刺激(COSTIMULATION)信號(第二信號),若缺乏第二信號的輔助,將使T細(xì)胞處于克隆無能(anergy)狀態(tài)。雖然CTLA-4在活化T細(xì)胞膜上的表達量僅為CD28的1/30～1/50,但它與B7的親和力是CD28與B7的20倍以上,是T細(xì)胞活化中重要的調(diào)節(jié)分子。CTLA-4單克隆抗體可以阻斷CTLA-4與T細(xì)胞的結(jié)合位點,從而阻斷T細(xì)胞的活化、增殖,進一步抑制CD4+CD25+Tr細(xì)胞的激活,使CD4+C

5、D25+Tr細(xì)胞在抑制機體對腫瘤細(xì)胞免疫作用減弱,近年來,CTLA-4單克隆抗體作為一種有效的治療手段顯示了其廣闊的應(yīng)用前景。CTLA-4單克隆抗體已在多種自身免疫性疾病、移植抗排斥、基因治療上進行廣泛的臨床應(yīng)用研究,但在惡性腫瘤,尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應(yīng)用還罕有研究。通過上面CTLA-4單克隆抗體作用機制的闡述,我們可以預(yù)測CTLA-4單克隆抗體在血液系統(tǒng)惡性疾病,尤其是惡性淋巴瘤的治療上會有廣闊的應(yīng)用。本試驗通過CTLA-4單克

6、隆抗體在荷淋巴瘤裸鼠體內(nèi)阻斷CD4+CD25+Tr細(xì)胞的活化、增殖,從而打破機體對腫瘤細(xì)胞的耐受,抑制腫瘤細(xì)胞生長。從而驗證CTLA-4單克隆抗體對淋巴瘤的作用。同時探討CTLA-4單克隆抗體在淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡中的作用及其可能的機制,為淋巴瘤的靶向治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 1人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株的培養(yǎng)和傳代
　　 人T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞用含10％新生小牛血清的RPMl1640培養(yǎng)液

7、培養(yǎng),置于37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,2-3d換液傳代。
　　 2荷人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞裸鼠模型的建立
　　 5周齡左右的Balb/c裸鼠,4Gy照射,3d后于右腋皮下接種Jurkat細(xì)胞每只0.2mL(每1mL含3×107個Jurkat細(xì)胞)。待瘤塊長至一定大小后,處死荷瘤裸鼠。無菌條件下將瘤塊分割成2-3mm的均勻小塊,注入10只5周齡左右的Balb/c裸鼠頭背部皮下。10d以后,發(fā)現(xiàn)瘤塊長勢良好

8、。隨機分為2組,分別為實驗組與空白組,每組5只,在腫瘤體積長至100mm3左右時開始給藥。
　　 3腹腔給藥
　　 將CTLA-4單克隆抗體稀釋為(2g/L),每只裸鼠腹腔內(nèi)注射0.2ml(約0.4mg),共兩天。
　　 4實際測量給藥后腫瘤生長情況
　　 用藥后測量腫瘤體積,每周2次,共4周。
　　 5處死裸鼠
　　 用藥后4周,處死所有裸鼠,剖取腫瘤組織,將每只裸鼠的腫瘤組織分為5部分

9、。并取血約1mL加入EDTA-K2抗凝。
　　 6 HE染色光鏡下觀察用藥前后腫瘤組織形態(tài)變化
　　 取腫瘤組織固定、脫水、浸蠟,制備成石蠟塊。切片,HE染色、封片,顯微鏡下觀察實驗組與空白組腫瘤組織形態(tài)。
　　 7免疫組織化學(xué)觀察用藥后腫瘤組織CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤情況
　　 取裸鼠腫瘤組織,固定、石蠟包埋、切片,SP法染色。參照試劑說明進行陽性結(jié)果判定,PBS緩沖液代替—抗作為陰性對照,以細(xì)胞內(nèi)

10、出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞。每張組織切片隨機觀察5個高倍視野(×200),每高倍視野計數(shù)200個細(xì)胞,以陽性細(xì)胞百分比為計數(shù)結(jié)果。
　　 8流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測用藥前后裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞的變化
　　 取EDTA-K2抗凝血0.1ml,分別加入CD4、CD25抗體各20μL,室溫下孵育30分鐘,加入紅細(xì)胞裂解液,用破膜劑及固定劑處理紅細(xì)胞,然后上機檢測。應(yīng)用Expo32 ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析,用Mu

11、ticycleAV分析對DNA細(xì)胞周期擬合分析。
　　 9半定量RT-PCR技術(shù)檢測Jurkat細(xì)胞β-catenin、survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表達
　　 提取每只裸鼠腫瘤細(xì)胞總RNA,鑒定RNA純度,檢測RNA完整性,引物設(shè)計,所有RT-PCR引物均由上海生物工程公司合成,細(xì)胞總RNA預(yù)溫后,加入逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)(二步法)反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。再進行PCR

12、擴增,取擴增產(chǎn)物,加樣于瓊脂糖凝膠加樣孔中,電泳30min,用凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝圖象,采用Gel-ProAnalyzer3.1分析軟件分析條帶光亮度,對其進行半定量分析實驗,計算相對系數(shù)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測腫瘤細(xì)胞周期的變化及凋亡
　　 將裸鼠腫瘤組織制備為單細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞周期變化及凋亡。
　　 11統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析
　　 結(jié)果:
　　

13、 1 CTLA-4單克隆抗體抑制人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖,在一定劑量下呈時間依賴關(guān)系。隨著藥物作用時間的延長,腫瘤細(xì)胞體積較空白組增長緩慢。可繪為時間、體積曲線圖。
　　 2光鏡下空白組裸鼠腫瘤細(xì)胞呈彌漫浸潤,瘤細(xì)胞為中等大小,核圓形或不規(guī)則圓形,核膜清楚,核分裂象易見,實驗組腫瘤細(xì)胞較空白組浸潤程度低,中等大小,核多為圓形,核膜清楚,核分裂相較少。
　　 3 CTLA-4單克隆抗體可降低裸鼠腫瘤組織中CD

14、4+及CD8+T細(xì)胞的比例。免疫組化分析結(jié)果顯示空白組CD4+T細(xì)胞浸潤比例為(57.5±1.3％),CD8+T細(xì)胞浸潤比例為(31.7±1.1％),實驗組CD4+T細(xì)胞比例為(25.3±0.9％),CD8+T細(xì)胞比例為(18.4±0.7％),兩組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4 CTLA-4單克隆抗體可降低裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例?？瞻捉MCD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例為(6.26±3.95)％,實驗

15、組CD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例為(1.96±0.92)％,空白組與實驗組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測結(jié)果顯示,人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞可擴增出特異性條帶,與擬擴增分子片段大小相符。經(jīng)CTLA-4單克隆抗體處理4周后,人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞β-catenin mRNA表達水平并沒有明顯變化,與空白組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而β-catenin/TCF下游靶基因c-myc、cyclinD

16、1和survivin mRNA表達水平卻降低了,與空白組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,CTLA-4單克隆抗體處理后,Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰,且細(xì)胞凋亡率明顯增加,CTLA-4單克隆抗體作用4周的細(xì)胞凋亡率(15.52％)明顯高于空白組細(xì)胞的凋亡率(3.46％);CTLA-4單克隆抗體作用后G0/G1期細(xì)胞(28.73％)較空白組(17.54％)明顯增加,S期細(xì)胞明顯減少,兩

17、組間差異有顯著性(P＜0.05),CTLA-4單克隆抗體能使細(xì)胞停滯在G0/G1期。
　　 結(jié)論:
　　 1在一定劑量下,CTLA-4單克隆抗體減緩人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖,呈時間依賴關(guān)系。
　　 2 CTLA-4單克隆抗體可使腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)浸潤程度減低。
　　 3經(jīng)CTLA-4單克隆抗體處理后,裸鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞浸潤比例減低。
　　 4 CTLA-4單