轉(zhuǎn)錄因子T-bet-GATA-3調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥及氣道重塑的機(jī)制研究.pdf

1、目的： 本研究擬探討哮喘患者PBMCs中轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3的比率與Thl/Th2細(xì)胞失衡的關(guān)系，并觀察體外CpG ODN干預(yù)后T-bet/GATA3比率的變化及其對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用；同時，觀察大鼠哮喘模型，肺內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及肺支氣管α-SMA和肺內(nèi)成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原等氣道重塑相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平，進(jìn)一步描述T-bet/GATA3比率與早期氣道重塑的關(guān)系。因

2、此，尋求T-bet/GATA-3的表達(dá)平衡點，采用CpG ODN干預(yù)，恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞平衡，及早阻斷氣道重塑的進(jìn)程，可能為支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新的更為有效的措施。 方法： 第一部分： (1)抽取30例發(fā)作期哮喘患者(哮喘組)、20例慢性阻塞性肺病患者(COPD組)及20例正常人(對照組)外周靜脈血6 ml，各加EDTA 0.8 mL抗凝，離心分離出血漿凍存待測，同時按密度梯度離心法分離PBMCs。采用

3、RT-PCR法測定各組PBMCs中T-bet mRNA和GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，ELISA法測定血漿中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的水平。(2)抽取20例發(fā)作期哮喘患者外周靜脈血10 ml，各加EDTA 1.2 mL抗凝，按密度梯度離心法分離出的PBMCs分為兩部分，一份加入CpG ODN和PHA培養(yǎng)48h(CpG組)，一份僅加入PHA培養(yǎng)48h(空白組)，培養(yǎng)后分別收集上清液和細(xì)胞沉淀，采用RT-PCR法測定細(xì)胞

4、沉淀中T-bet和GATA-3的mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，ELISA法測定上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFNγ的表達(dá)水平。 第二部分：健康WT(wistar)大鼠(山東大學(xué)試驗動物中心，SPF級)30只，雌雄不拘，6-8周齡，體重(200±50)g，置于同一飼養(yǎng)室內(nèi)，自由飲水和攝食。將大鼠隨機(jī)分為空白對照組(Blank Group)、生理鹽水組(Saline Group)、OVA組(OVA Group，哮喘模型組)各10只

5、。采用實時定量．聚合酶鏈反應(yīng)(QuantitativeReal-time PCR)法測肺組織中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，免疫印跡法(western blotting)測肺組織中T-bet和GATA-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。分離各組肺成纖維細(xì)胞，傳至3-4代后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定成纖維細(xì)胞提取物中Ⅰ型膠原的表達(dá)強(qiáng)度。免疫組化法測定肺組織中α-SMA的表達(dá)水平，以及分別比較T-bet和GATA-3

6、mRNA和蛋白的比率變化與α-SMA和I型膠原的變化關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用SPSS10.0軟件處理。樣本問均數(shù)的比較采用t檢驗，變量間的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1．哮喘組PBMCs中T-bet mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較COPD組及對照組顯著減弱(P<0.05)，而GATA-3 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較其他兩組顯著增強(qiáng)(

7、P<0.05)；COPD組PBMCs中T-bet mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較對照組增強(qiáng)(P>0.05)，GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較對照組減弱(P>0.05)。 2．哮喘組血漿中IL-4、IL-5和IL-13的水平較COPD組及對照組均顯著增高(P<0.05)：IFN-γ的水平較COPD組顯著降低(P<0.05)，也較對照組降低(P>0.05)。 3． COPD組血漿中IFN-γ的水平較其他兩組顯著增高(P<0.05)，I

8、L-13的水平較其他兩組顯著降低(P<0.05)。而IL-4和IL-5的水平相應(yīng)地較其他兩組降低(P>0.05)。 4．哮喘組T-bet/GATA-3的比率較COPD組及對照組顯著降低(P<0.05)。COPD組T-bet/GATA-3比率較對照組增高(P>0.05)。 5．T-bet mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與IFN-γ的水平成正相關(guān)(r=0.675，P<0.05)，與IL-4、IL-5和IL-13的水平成負(fù)相關(guān)(r=0.7

9、8,r=-0.664，r=-0.546，P<0.05)。 6． GATA-3 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與IFN-γ的水平成負(fù)相關(guān)(r=-0.446，P<0.05)，與IL-4、IL-5和IL-13的水平成正相關(guān)(r=0.518，r=0.393，r=0.350，P<0.05)。 7．T-bet/GATA-3的比率與IFN-γ的水平成正相關(guān)(r=0.833，P<0.05)，與IL-4、IL-5和IL-13的水平成負(fù)相關(guān)(r=-0.

10、779、r=-0.631，r=-0.584，P<0.05)。 8． CpG組上清液中IL-4、IL-5和IL-13的水平分別較空白組顯著降低(P<0.05)，IFN-7的水平較空白組顯著(P<0.05)。 9． CpG組的細(xì)胞沉淀中T-bet mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較空白組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，GATA-3 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度顯著減低(P<0.05)；T-bet/GATA-3的比率較空白組顯著增高(P<0.05)。

11、 10．OVA組肺組織中T-bet mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較空白對照組和生理鹽水組顯著減弱(P=8.317x10<'-8>P=8.487x10<'-6>)；而GATA-3 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較其余兩組顯著增強(qiáng)(P=2.2x10<'-16>，P=2.3x10<'-16>)；T-bet/GATA-3的比率較其余兩組顯著減弱(P==7.748x<'0.7>，P=9.645x<'-0.6>)?？瞻讓φ战M和生理鹽水組二者之間差異無顯著性(P=0.

12、1307，P=0.605．P=0.056)。 11．OVA組肺組織中T-bet蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較其余兩組顯著減弱(P=1.433x10<'-14>H，P=4.926x10<'-7>)；而GATA-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較其余兩組顯著增強(qiáng)(P=2.149x10<'-10>，P=4.409x10<'-9>)：T-bet/GATA-3的比率較其余兩組顯著減弱(P=2.287x<'-0.8> ，P=2.969x<'-0.6>)；空白對照組和生理

13、鹽水組二者之間差異無顯著性(=0.4987，P=0.6077，P=0.7859)。 12．OVA組肺中支氣管的α-SMA的表達(dá)較其余兩組顯著增強(qiáng)(P=8.447x10<'-3>，P=7.883x10<'-3> )。 13．OVA組的成纖維細(xì)胞(LF)提取物中的I型膠原含量顯著高于其余兩組(P=1.603x10<'-6>，P=1.458x10<'-6>)。 14．T-bet/GATA-3的mRNA和蛋白的比率與α-

14、SMA的水平呈負(fù)相關(guān)的r值分別為(r=-0.8274，r=-0.9783)(p=3.742x10<'-6>，p=6.905x10<'-6>)，與I型膠原的水平亦呈負(fù)相關(guān)的r值分別為(r=0.779，r=-0.9449)(p=-3.811×10<'-8>，P=1.603x10<'-6>)。 結(jié)論： 1．T．bet/GATA-3比例是評價支氣管哮喘患者Th1/Th2失衡更為準(zhǔn)確的指標(biāo)。 2．CpG ODN可以通過調(diào)節(jié)