石斛粉抗糖尿病性白內(nèi)障靶標蛋白AR與iNOS相互作用初步研究.pdf

1、目的:
　　研究抗糖尿病性白內(nèi)障靶標蛋白醛糖還原酶(AR)與一氧化氮合酶(iNOS)之間的相互作用，以及探討石斛活性成分石斛酚對二者相互作用的影響，從而深入闡明石斛抗糖性白內(nèi)障的機理，為其開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.免疫共沉淀技術(shù)(CO-IP)檢測AR與iNOS的相互作用，以iNOS抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)，用western blot檢測AR蛋白，并初步比較石斛酚作用后對其相互作用的影響。
　　2.以E

2、GFP-AR作為供體，Cy3-iNOS為受體，運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體光漂白技術(shù)進一步研究AR與iNOS的相互作用，得出石斛酚作用前后EGFP-AR與Cy3-iNOS間的能量轉(zhuǎn)移率及距離。
　　結(jié)果:
　　1.免疫共沉淀技術(shù)(CO-IP)結(jié)果表明，選擇iNOS的免疫共沉淀抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)，抗體、蛋白和葡萄糖磁珠結(jié)合，形成蛋白-抗體-proteinG agaros復合物，western blot可以檢測到AR蛋白的表達。

3、表明AR與iNOS存在相互作用，經(jīng)過石斛酚作用后相互作用略增強。
　　2.Cy3和EGFP作為供受體對，使用FRET受體光漂白技術(shù)檢測AR與iNOS的相互作用。AR與iNOS在人晶狀體上皮細胞(HLEC)整個細胞中均有表達，并且二者具有共定位。選擇細胞共定位的區(qū)域進行漂白，當受體Cy3-iNOS的熒光被漂白后，供體EGFP-AR的熒光顯著增強，出現(xiàn)了FRET現(xiàn)象。通過計算，得出AR與iNOS相互作用的能量轉(zhuǎn)移率為38.37±4.7

4、6％(n=10)，石斛酚作用之后其能量轉(zhuǎn)移率為43.12±2.69％(n=10)，與對照組4.23±1.04％(n=4)相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。AR與iNOS相互作用的距離為6.50±0.22nm，石斛酚作用后AR與iNOS相互作用的距離為6.28±0.12nm，與對照組10.14±0.44nm相比較，差異具有顯著的統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。石斛酚處理后與非處理組比較能量轉(zhuǎn)移率增加，相互作用的距離變小(p＜0.0