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文檔簡介
1、目的:糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)現在已成為全世界成年人人群中的主要致盲眼病,其發(fā)病率逐年增加。以視網膜異常新生血管為特征的增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是導致糖尿病性視網膜病變患者視力喪失的主要原因之一。約1/3的糖尿病患者最終會發(fā)展為PDR期。
目前有眾多臨床和實驗研究表明,高血糖在PDR的發(fā)生和發(fā)展中起到了關
2、鍵作用。高血糖可以引起視網膜內多種損傷,如蛋白激酶C、多元醇途徑、己糖胺生物合成途徑的異常激活,以及過度產生糖基化終末產物等,這些高血糖誘導的損傷還可以導致過度的氧化應激反應,從而進一步損害視網膜組織。同時,目前也有研究表明高血糖本身就具有促進視網膜異常新生血管的功能。
目前研究認為,玻璃體內血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量增高是PDR視網膜新生血管形成的關
3、鍵。VEGF可誘導視網膜血管內皮細胞增殖、遷移、血管管腔形成并導致異常新生血管的產生。異常的新生血管會引起玻璃體積血、牽拉性視網膜脫離、新生血管性青光眼等并發(fā)癥,最終造成患者視力損害。目前有多種抗VEGF類藥物應用于治療DR,這些藥物包括:貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普等。然而長期眼內注射抗VEGF藥物會增加眼部并發(fā)癥的風險,并且目前有研究表明在糖尿病患者人群中,長期眼內注射抗VEGF藥物造成的全身并發(fā)癥較其它人群明顯增高,這些
4、全身并發(fā)癥包括高血壓、血栓形成以及傷口延遲愈合等。這是因為糖尿病患者在眼內VEGF含量及新生血管活動增多的同時,體內其它組織如心臟和足等組織VEGF含量和新生血管活動降低。因此進一步研究DR引起新生血管的機制以及開發(fā)新的藥物靶點是當務之急。
哺乳動物體內細胞的氧化還原主要由谷胱甘肽(glutathione(GSH))和硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)這兩個系統(tǒng)來調控。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-
5、interacting protein,TXNIP)又稱維生素D3上調蛋白1(vitamin D3-upregulated protein1,VDUP-1)是TRX系統(tǒng)中的內源性抑制蛋白。已有研究表明高糖刺激能引起多種視網膜細胞尤其是視網膜血管內皮細胞高表達TXNIP,而高表達的TXNIP在調節(jié)視網膜的炎癥反應及氧化應激方面有重要的作用。同時,最新的研究表明,TXNIP與血管內皮細胞新生血管活動有著緊密聯系,TXNIP通過與Rab5形成
6、復合物,參與到VEGF-VEGFR2信號通路及其下游的PLC-γ通路,從而調節(jié)VEGF介導的內皮細胞新生血管功能。也有研究顯示TXNIP基因敲除小鼠的VEGFR2/Akt通路功能及新生血管功能受損,當過表達TXNIP后其新生血管能力得到了恢復。然而TXNIP在PDR中所起到的作用目前尚無研究。
本研究目的在于闡明高糖引起的人視網膜微血管內皮細胞(Human retinal microvascular endothelial c
7、ells, HRMECs)高表達TXNIP在高糖引起的細胞新生血管活動中所起到的作用及機制,以及敲除HRMECs的TXNIP基因對于高糖及VEGF所引起的新生血管活動的影響。同時我們通過視網膜新生血管體外培養(yǎng)模型,研究TXNIP基因敲除對于小鼠視網膜新生血管能力的影響。為進一步闡明TXNIP在PDR中所起到的作用及機制提供理論依據。
方法:
1.高糖對HRMECs增殖、遷移、管腔形成的影響。
HRMECs在
8、37℃,5%CO2的條件下,以含有5%胎牛血清,1%內皮細胞生長補充劑(ECGS),100U/ ml青霉素和100μg/ ml鏈霉素的ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(1)CCK-8實驗測定高糖對HRMECs增殖的影響:用正常濃度糖(Control,5.6mM),中度高糖(MHG,15mM)和高糖(HG,30mM)刺激 HRMECs細胞。孵育24小時后,向每個孔中加入10μl CCK-8,然后再孵育2小時。當從紅色變?yōu)辄S色時,用分光光度計在450n
9、m波長下測定各組的光密度(OD)值。(2)細胞劃痕實驗評估高糖對HRMECs遷移的影響:將HRMECs置于24孔板上并培養(yǎng)至90%細胞密度。在無血清培養(yǎng)基中孵育6小時后,用1ml黃色移液管尖端刮除單層細胞。隨后,用PBS洗滌細胞三次以去除浮游細胞,并給予不同的刺激。在0小時和18小時拍攝細胞圖像,分析平均細胞移動距離。(3)Transwell遷移實驗測定高糖對HRMEC遷移的影響:在5%CO2培養(yǎng)箱中將HRMECs在各種不同條件下培養(yǎng)2
10、4小時。然后,將細胞以1×105個細胞/孔的密度接種在含有200μl無血清培養(yǎng)基的Transwell小室中。同時將600μl的不同糖濃度的培養(yǎng)基加入到Transwell小室下方孵育6小時。6小時后,將Transwell在4%多聚甲醛中固定并用結晶紫染色。用棉簽刮取 Transwell的上表面以除去未遷移的細胞。對 Transwell進行拍照,通過隨機計數5個顯微鏡視野來確定遷移的細胞數。(4)Matrigel管腔形成實驗測定高糖對HRM
11、ECs管腔形成的影響:將不同濃度糖培養(yǎng)基預處理的HRMECs(每孔5×104個細胞)接種在Matrigel的表面上,再培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結束時拍攝細胞圖像,并使用Image-Pro Plus6.0軟件評估每個視野的總管腔形成長度。(5)中度高糖對HRMECs VEGF分泌的影響:通過使用ELISA試劑盒評估來自不同組HRMECs細胞的上清液中的VEGF濃度。(7)中度高糖對HRMECs的Akt/mTOR通路影響:使用蛋白免疫印跡法檢測中度
12、高糖條件下HRMEC中Akt和mTOR的表達。
2.TXNIP在中度高糖促進的HRMECs遷移和管腔形成中的作用(1)中度高糖對 HRMECs的TXNIP變化的影響:中度高糖刺激HRMECs,并在不同點收取細胞,通過蛋白免疫印跡法檢測細胞 TXNIP的變化。(2)中度高糖對HRMECs細胞內ROS的影響:HRMECs細胞內ROS水平的檢測采用2’,7’-DCFH-DA探針法,將HRMECs均勻接種于6孔板中,細胞匯合度達到80
13、%密度時更換無血清ECM培養(yǎng)基同步,6 h后按實驗分組加入不同刺激物干預,后換成含2’,7’-DCFH-DA探針(終濃度為10μmol/L)的無血清ECM培養(yǎng)基,37 ℃下避光孵育30 min,PBS洗滌3遍,將未結合的2’,7’-DCFH-DA充分沖洗掉,流式細胞儀檢測熒光強度,用熒光強度反應細胞內ROS含量。(3)檢測TXNIP對中度高糖誘導的HRMECs新生血管形成的影響:細胞隨機分為正常糖對照組(5.5 mmol/L gluco
14、se,Control)、中度高糖(15 mmol/L glucose,MHG)、載體對照組(Scr siRNA轉染,Scr siRNA)、中度高糖+載體對照組(Scr siRNA+15 mmol/L glucose,Scr siRNA+MHG)、TXNIP siRNA轉染組(TXNIP siRNA單純轉染,TXNIP siRNA)、中度高糖+TXNIP siRNA轉染組(TXNIP siRNA+15 mmol/L glucose,TXN
15、IP siRNA+MHG)、中度高糖+抗氧化劑NAC組(NAC+15 mmol/L glucose,NAC+MHG)。分組刺激后進行細胞劃痕實驗,Transwell遷移實驗,Matrigel管腔形成實驗檢測 HRMECs新生血管形成情況。并用蛋白免疫印跡法檢測敲除TXNIP基因對MHG誘導的HRMECs的Akt/mTOR信號通路的影響。
3.TXNIP在VEGF促進的HRMECs遷移和管腔形成中的作用。檢測TXNIP對重組人V
16、EGF165(20 ng/ml)誘導的HRMECs新生血管形成的影響:細胞隨機分為正常培養(yǎng)組(Control)、VEGF165刺激組(20 ng/ml VEGF165,VEGF)、載體對照組(Scr siRNA轉染,Scr siRNA)、VEGF165+載體對照組(Scr siRNA+20 ng/ml VEGF165, Scr siRNA+VEGF)、TXNIP siRNA轉染組(TXNIP siRNA單純轉染,TXNIP siRNA)
17、、VEGF165+TXNIP siRNA轉染組(TXNIP siRNA+20 ng/ml VEGF165,TXNIP siRNA+VEGF)、VEGF165+抗氧化劑NAC組(NAC+20 ng/ml VEGF165,NAC+VEGF)。相應細胞分組進行CCK-8實驗、細胞劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Matrigel管腔形成實驗檢測HRMECs的新生血管活動。Scr siRNA組和TXNIP siRNA組以VEGF165(20
18、ng/ml)刺激5min,15min,30min,45min,1h,2h,4h后以蛋白印跡實驗方法對各組細胞的VEGFR2、Akt及mTOR蛋白進行定量分析。
4 TXNIP基因敲除對小鼠視網膜新生血管的影響。本研究以6周齡C57BL/6J背景的野生型小鼠(Wild type,WT)及相同背景的TXNIP基因敲除小鼠(TXNIP?/?)為動物模型;TXNIP基因敲除鼠模型的構建采用TALEN技術,用PCR實驗檢測其子代的基因表
19、型。實驗動物分為2組,野生型C57BL/6J小鼠組(WT)及TXNIP基因敲除小鼠組(TKO),每組小鼠各6只。小鼠處死后完整取出眼球,將其以無菌生理鹽水充分沖洗。手術顯微鏡下以15°側切刀沿角膜緣切開眼球,去除角膜、晶體和玻璃體,沿鞏膜完整剝離神經視網膜組織,并去除視網膜粘附的脈絡膜組織及視網膜色素上皮細胞。將提取的視網膜組織環(huán)形剪除約0.2mm寬周邊視網膜組織,以視神經為中心,用小梁剪剪為均勻的4塊視網膜組織。將視網膜組織放入預冷的
20、無血清ECM培養(yǎng)基中2小時。來源于同一眼球的視網膜組織塊分到不同的刺激組。將視網膜組織平鋪在提前凝固的Matrigel基質膠上,神經纖維層面朝上,并使視網膜的邊緣與基質膠充分接觸。平鋪好視網膜組織后在其上再加入液態(tài)的1:1培養(yǎng)基比例的基質膠300ml,室溫放置1h固定?;|膠凝固后在每個孔內放入不同刺激的培養(yǎng)基500ml,分別為:Control組(無刺激物培養(yǎng)基);中度高糖組(15 mmol/L glucose, MHG);VEGF組(
21、20ng/ml VEGF);中度高糖+VEGF組(15 mmol/L glucose+20ng/ml VEGF,MHG+VEGF)。每2天換一次培養(yǎng)基。實驗第10天在倒置顯微鏡下觀察視網膜新生血管長出情況并拍照。
結果:
1.中度高糖通過激活HRMECs的Akt/mTOR通路誘導遷移和管腔形成,但不引起HRMECs增殖。
1) HRMECs在不同濃度高糖培養(yǎng)24小時后,通過CCK-8實驗方法檢測其吸光度。結
22、果表明無論是MHG組還是HG組細胞增殖較對照組無顯著性差異(P>0.05)。
2)通過細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗方法研究不同濃度高糖對 HRMECs遷移能力的影響, MHG組與對照組相比有顯著性差異(P<0.01),而HG組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。
3)通過使用 Matrigel管腔形成實驗的方法研究不同濃度高糖對于HRMECs管腔形成的影響。MHG組HRMECs管腔總長度較對照組有明
23、顯的增加(P<0.05),HG組HRMECs管腔總長度較對照組無顯著性差異(P>0.05)。
4)收集在MHG刺激下不同時間點的細胞培養(yǎng)基上清液,并用ELISA試劑盒分析其VEGF含量。結果表明,HRMECs本身自分泌的VEGF量極少,并且MHG并不影響HRMECs自分泌VEGF含量的變化(P>0.05)。
5)通過蛋白印跡實驗方法檢測Akt和mTOR的磷酸化變化,結果顯示,MHG組Akt及其下游通路mTOR的磷酸化
24、較對照組增加(P<0.05)
2.敲除HRMECs細胞的TXNIP抑制MHG引起的Akt/mTOR信號通路激活,進而降低MHG引起的遷移和管腔形成能力。
1)通過蛋白印跡實驗方法檢測HRMECs在不同MHG刺激時間下的TXNIP變化。結果顯示TXNIP在2h、4h、6h表達升高(P<0.05或P<0.01)。
2)MHG刺激會短暫性的升高 ROS,分別在5 min,30min,45min的時間點與對照組有顯
25、著性差異(P<0.05或P<0.01)。而1h至24H其細胞內ROS較正常無顯著性差異(P>0.05)。
3)用TXNIP小干擾RNA(TXNIP siRNA)轉染HRMECs,并用載體對照組小干擾RNA(Scrambled siRNA,Scr siRNA)作對照組,研究TXNIP基因敲除對HRMECs細胞新生血管活動的影響。細胞劃痕實驗及Transwell遷移實驗及 Matrigel管腔形成實驗表明,TXNIP siRNA組
26、在MHG刺激下的新生血管能力明顯下降(P<0.01)。
4)敲除TXNIP基因阻斷了MHG對于HRMECs的Akt/mTOR信號通路的激活(P<0.01)。
5)抗氧化劑 NAC也可以降低 MHG引起的遷移和管腔形成能力(P<0.01)。
3.敲除TXNIP基因阻礙VEGF誘導的VEGFR2信號通路激活,進而降低VEGFR2引起的HRMECs新生血管活動。
1)HRMECs在VEGF下,其細胞增殖
27、能力、遷移能力、管腔形成能力明顯增加(P<0.01)。
2)敲除TXNIP基因后降低了VEGF誘導的HRMECs新生血管活動(P<0.01)。
3)敲除TXNIP基因降低了VEGF引起的HRMECs細胞的VEGFR2及其下游通路Akt/mTOR激活(P<0.01)。
4)使用 NAC后,VEGF誘導的HRMECs新生血管活動均有降低(P<0.01)。
4.TXNIP基因敲除對體外培養(yǎng)的小鼠視網膜新
28、生血管的影響
1)在缺乏VEGF刺激的條件下,體外培養(yǎng)的視網膜生長出新生血管芽的能力非常低,VEGF+MHG組較VEGF組小鼠視網膜新生血管能力增強(P<0.05)。
2)TKO小鼠視網膜新生血管能力明顯降低(P<0.01)。
3)TXNIP基因敲除對于小鼠玻璃體內VEGF含量無明細影響。
結論:
1.中度高糖能引起HRMECs的遷移和管腔形成。這并不是由中度高糖刺激HRMECs自分泌產
29、生更多的VEGF引起,而是通過激活Akt/mTOR通路引起的。同時中度高糖也能引起HRMECs細胞內ROS的短暫升高。
2.中度高糖能誘導HRMECs的TXNIP過表達,當敲除HRMECs的TXNIP后,中度高糖引起的HRMECs遷移和管腔形成能力將被抑制。同時其激活Akt/mTOR信號通路的能力也被抑制??寡趸瘎㎞AC也可以抑制中度高糖誘導的HRMECs遷移和管腔形成能力。
3.敲除HRMECs的TXNIP將會抑制
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