家蠶translin蛋白的初步研究.pdf

1、Translin又名轉(zhuǎn)位蛋白,是一種可以與DNA/RNA相結(jié)合,分子量大約27 kD,進(jìn)化保守的蛋白。在細(xì)胞內(nèi)參與染色體重組、修復(fù)及細(xì)胞分裂等多種生物學(xué)活動。在它的三級結(jié)構(gòu)中有一段保守的亮氨酸拉鏈區(qū),對于形成多聚體是必須的。Translin蛋白與mRNA的3'端非編碼序列相結(jié)合,進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯。Translin蛋白還參與端粒長度調(diào)節(jié),與一些腫瘤發(fā)病有關(guān)。
　　 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶cDNA文庫中克隆到一條ORF長度

2、為708bp的家蠶translin基因。經(jīng)NCBI中BLAST比對將其命名為BmTLP(for translin-like proteinfrom.Bombyx mori),該基因編碼235個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測分子量為27.259 kD,等電點(diǎn)為5.87。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)PCR引物,克隆目的基因。其中BamHⅠ和XhoⅠ是該基因克隆時(shí)的兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將雙酶切的PCR產(chǎn)物融合到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pE

3、T-28a(+)-BmTLP。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的重組蛋白以可溶形式存在,經(jīng)過鎳柱親和層析純化后,經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純化,再進(jìn)行質(zhì)譜分析證實(shí)該蛋白表達(dá)的正確性。以純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得該蛋白的多克隆抗體,經(jīng)ELISA檢測,抗體效價(jià)可達(dá)1:25600以上。為了解該蛋白在家蠶中各時(shí)期及各組織中的分布,做了Western blotting和熒光定量PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示五齡幼蟲的各組