家蠶濃核病毒(BmDNV-1)結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)及其啟動子活性的初步研究.pdf

1、家蠶濃核病毒(Bombyx mori demovirus-1,BmDNV-1)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae),濃核病毒亞科(Densovirinae),重復(fù)病毒屬(Iteravirus)。家蠶濃核病毒BmDNV-1是1968年從日本長野縣病蠶中分離得到的。家蠶濃核病毒BmDNV-1感染宿主后,主要癥狀為病蠶軟化、中腸的圓筒型細(xì)胞呈濃核癥,因此對家蠶養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害。
　　 家蠶濃核病毒BmDNV-1病毒粒子直徑

2、大約20hm,無囊膜,病毒衣殼呈二十面體結(jié)構(gòu),其基因組為全長5076 bp的線性單鏈DNA,擁有兩個大的重疊基因,5'端為非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins)基因,編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NS1(89.3KDa)和NS2(56KDa)。其3’端部分有一簡單的開放閱讀框用于編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(structural proteins VPs),VP1(74.9KDa)、VP2(64.3 KDa)、VP3(54.9 KDa)

3、、VP4(51.6 KDa)。最大的衣殼蛋白VP1的N-末端獨(dú)特區(qū)基序具有磷脂酶A2活性,該酶活性對于病毒成功進(jìn)入和感染宿主細(xì)胞是必須的,在病毒感染過程中具有重要作用。此外,家蠶濃核病毒BmDNV-1其基因組上有兩個啟動子,即非結(jié)構(gòu)基因啟動子及結(jié)構(gòu)基因啟動子。
　　 目前對于家蠶濃核病毒的研究主要集中于對其基因的表達(dá),關(guān)于編碼蛋白質(zhì)功能和基因表達(dá)的調(diào)控等方面研究較少,由于缺乏敏感細(xì)胞系,家蠶濃核病毒BmDNV-1的轉(zhuǎn)錄與翻譯機(jī)制

4、目前還沒報道。
　　 本文根據(jù)家蠶濃核病毒BmDNV-1的感染性克隆PIN919(GeneBank accessionnumber:AY033435)為模板設(shè)計引物擴(kuò)增了VP基因的獨(dú)特區(qū)vplu,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-vplu和pMal-e2X-vplu,進(jìn)行了蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化,為進(jìn)一步多克隆抗體的制備打下一定基礎(chǔ)。同時,本文利用了Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)成功的表達(dá)了BmDNV-1的結(jié)構(gòu)蛋白VP1

5、,并且探究了VP1與VP1-u之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,在BmDNV-1中結(jié)構(gòu)蛋白基因vpl在真核表達(dá)時,沒有出現(xiàn)VP1u的截短表達(dá)。此外,本文利用熒光素酶報告系統(tǒng)對BmDNV-1的結(jié)構(gòu)基因啟動子活性進(jìn)行了初步探究,結(jié)果顯示BmDNV-1結(jié)構(gòu)基因啟動子(VP-promoter)在Bmn細(xì)胞中基本沒有活性,在C636細(xì)胞中有一定活性,在Ld652、Sf9細(xì)胞中有較高的活性,同時通過pGL-VP-promoter-luc+與調(diào)控質(zhì)粒pIZT／V