燙傷大鼠結腸Kit、Kitl及Gja1基因表達與胃腸動力障礙的實驗研究.pdf

1、在嚴重燙傷患者，早期及后續(xù)病程中常伴有腹部脹氣、腸鳴音減弱或消失、腸麻痹等胃腸道運動障礙的表現(xiàn)。以往研究者多將這些癥狀歸因于：燙傷后應激反應性高血糖，及其所引起的下丘腦飽感中樞抑制；交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮；傷后血中兒茶酚胺濃度增高，使得腸肌緊張性減弱、運動受到抑制；腸管壁內某些腦啡肽的釋放；低鉀血癥導致平滑肌細胞膜超極化等[1]。而對于燙傷后是否伴有胃腸道平滑肌細胞的節(jié)律性電活動(由其引發(fā)平滑肌的節(jié)律性舒縮運動)的產(chǎn)生機制及其相關調控因子

2、的改變，尚少見研究報道。 Cajal間質細胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)是一種廣泛分布于哺乳動物胃腸道的特殊間質細胞。除了作為起搏細胞，自發(fā)地產(chǎn)生并傳導節(jié)律性的去極化波(慢波)，從而引發(fā)胃腸平滑肌的規(guī)律性收縮外[2]，它還參與了植物神經(jīng)、腸神經(jīng)和某些胃腸激素對胃腸運動的調節(jié)過程，并與胃腸道間質細胞瘤的發(fā)生密切相關。已經(jīng)知道，一些伴有胃腸道動力減退表現(xiàn)的疾病如：胃食管反流病、慢傳輸型便秘、糖尿

3、病性胃輕癱等，都不同程度的伴有Caial間質細胞形態(tài)、結構和功能的損害，且其受損程度與胃腸道運動功能減退的輕重有關。而對于嚴重燙傷后腸道Caial間質細胞的形態(tài)、功能、其影響調控因子的改變，以及與胃腸道動力障礙之間關系的研究迄今還較少見到。 目的：通過測定7cm×4cm面積的Ⅲ度燙傷大鼠的腸道推進速率，結腸組織中三種與Cajial間質細胞的平滑肌電起搏活動相關的蛋白基因-Kit(編碼ICC胞膜上具酪氨酸蛋白激酶活性的c-kit受

4、體)、Kitl(編碼c-kit的配體—干細胞因子SCF)及Gjal(慢波產(chǎn)生與傳導所必需的縫隙連接蛋白Cx43的編碼基因)相應mRNA的表達水平，探討燙傷對大鼠結腸組織中上述三種基因表達的影響，以初步了解嚴重燙傷后腸道ICC功能上的變化，及其與胃腸道動力障礙之間可能的聯(lián)系。 方法：56只健康成年Sprague-Dawley大鼠隨機分為2組，燙傷補液組48只(以下簡稱燙傷組)、正常對照組8只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)1周，實驗開始前禁食1

5、2h，自由飲水。燙傷組大鼠腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛并浸入97℃以上熱水中15s，造成7cm×4cm的Ⅲ度燙傷創(chuàng)面(方法參照《燒傷治療學》)。傷后即給予乳酸鈉林格液腹腔注射行液體復蘇(50ml/kg)；對照組未做特殊處理。燙傷組大鼠分別于傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h(正常對照組于禁食12h后)無痛斷頸處死。立即剪取上段結腸組織各約100mg，裝入EP管置液氮生物容器保存；大鼠處死前30min并行碳素墨水灌胃(

6、1ml/只)。處死后即快速小心分離出胃至結腸上段全長，無張力狀態(tài)下平鋪于桌面白紙上，直尺測量其墨水推進最遠端距離幽門的長度，并用以表示大鼠腸道推進速率。所獲大鼠結腸樣本經(jīng)低溫下研磨，TRIzol R、氯仿等提取總RNA，并由逆轉錄過程獲得相應cDNA后，部分轉移至含有Kit、Kitl等基因的相應引物及dNTP、SYBR R GREEN Ⅰ試劑的新反應體系，行多聚酶鏈反應—實時熒光定量PCR(Real Time quantitaftve

7、PCR)。最后將部分PCR反應擴增產(chǎn)物轉入瓊脂糖凝膠，電泳、鑒定。 結果： ①腸道推進速率：傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h燙傷組均明顯低于正常對照組水平，差異學意義(p＜0.05)。 ②2-△△Ct值(熒光定量PCR)：傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h，燙傷組Gja1、Kit1對應的2-△△Ct值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。燙傷組Kit 2-△△Ct值則于傷后6h、

8、9h、16h、24h、48h明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；傷后3h雖有降低，但與對照組間差異不顯著(p＞0.05)。 結論：燙傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h，在大鼠胃腸道運動功能明顯抑制的同時，結腸組織中編碼胞間縫隙連接蛋白的Gial基因以及干細胞因子SCF的編碼基因Kit1表達明顯減弱；而與Cajal間質細胞功能密切相關的c-kit蛋白編碼基因Kit表達則于傷后6h、9h、16h、24h、48

9、h明顯低于對照組；三者的水平在傷后48h后均有不同程度回升，但與對照組比較仍有顯著的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。上述指標的變化大體與大鼠胃腸道運動速率的變化趨勢一致。鑒于Caja1間質細胞產(chǎn)生并傳導了絕大多數(shù)胃腸運動發(fā)生所必需的起搏電流，而Kit、Kit1、Gja1編碼的蛋白對于維持其起搏電位的產(chǎn)生、傳導以及頻率的正常至關重要，上述三種基因表達的改變(下降)會對機體的胃腸運動功能產(chǎn)生較明顯的影響。本次實驗中測得燙傷大鼠結腸組織中三種基因