Desmuslin在原發(fā)性靜脈曲張發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、靜脈曲張是最常見的外周血管疾病，在30-70歲的人群中靜脈曲張的發(fā)病率高達(dá)10-40％。靜脈曲張除了影響美觀外還可以嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量及降低社會的勞動力。目前的治療手段包括手術(shù)治療，血管內(nèi)射頻及激光消融和泡沫硬化劑的注射，但是術(shù)后10年內(nèi)的復(fù)發(fā)率約為1/3，而后兩種方法雖然3年內(nèi)的治療效果與手術(shù)相似，但其遠(yuǎn)期效果尚不得而知。因此從長遠(yuǎn)的眼光來看，研究靜脈曲張發(fā)生的分子及細(xì)胞機(jī)制，對于尋找新的治療靶點及發(fā)展新的治療策略具有重要的意義

2、。
　　 近年來越來越多的證據(jù)表明原發(fā)性靜脈壁薄弱是靜脈曲張致病的始發(fā)因素。是什么導(dǎo)致了原發(fā)性靜脈壁的薄弱？正常情況下，膠原、彈性纖維及平滑肌細(xì)胞控制著靜脈壁的可擴(kuò)張性，平滑肌細(xì)胞控制靜脈壁主動張力的維持，而膠原及彈性纖維控制著靜脈壁被動張力的維持，無論哪種成分有缺陷，都可以導(dǎo)致靜脈壁張力的喪失。從形態(tài)學(xué)及功能學(xué)上都有研究提示靜脈曲張病人的血管平滑肌細(xì)胞表型或者說其分化狀態(tài)發(fā)生了改變，而這種改變可以引起靜脈壁一系列的變化，包括靜

3、脈壁對內(nèi)源性血管收縮因子的反應(yīng)的降低導(dǎo)致靜脈壁主動維持張力的能力下降及細(xì)胞外基質(zhì)的紊亂導(dǎo)致靜脈壁被動維持張力的能力下降，從而導(dǎo)致了靜脈壁的薄弱和擴(kuò)張。但是以往的研究多通過電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)的改變來推斷曲張靜脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生的改變，也有研究通過培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞觀察其某一方面的功能，比如有研究比較曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞與正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞膠原I及膠原III的合成，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞所合成的膠原可以反應(yīng)組織中膠原的情況，體

4、外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞在一定程度上保留了其在體內(nèi)的生物學(xué)特性，因此我們可以利用體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞來分析其在體內(nèi)的生物學(xué)特性。目前還沒有一個研究全面的探討靜脈曲張病人血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為與正常靜脈平滑肌細(xì)胞之間的差別。
　　 有研究者認(rèn)為靜脈曲張病人平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變有可能是因為基因的缺陷所造成的，因此它才能在體外培養(yǎng)時也表現(xiàn)出其異常的功能。流行病學(xué)研究也提示靜脈曲張的發(fā)病具有高度的遺傳傾向。近年來大量的研究已經(jīng)通過

5、不同的方法篩選曲張大隱靜脈與正常大隱靜脈差異表達(dá)的基因，試圖從中找出靜脈曲張致病相關(guān)基因。目前篩選出來的差異表達(dá)基因涉及到細(xì)胞代謝、細(xì)胞外基質(zhì)的組裝及細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)包括細(xì)胞骨架、肌動蛋白的組裝等方面。但是這些差異表達(dá)的基因究竟在靜脈曲張的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了什么作用，目前的報導(dǎo)很少。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)一種叫Desmuslin的基因在曲張靜脈中的表達(dá)明顯下調(diào)。Desmuslin又稱為β-synemin，是一種VI型中間絲

6、蛋白，最初被認(rèn)為是α-dystrobrevin蛋白結(jié)合蛋白，α-dystrobrevin蛋白是dystrophin(抗肌萎縮蛋白)復(fù)合物(DAPC)的組成部分，DAPC是細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)骨架之間聯(lián)系的橋梁，為骨骼肌細(xì)胞提供機(jī)械支持，DAPC的病變與多種骨骼肌的遺傳性疾病相關(guān)。在平滑肌細(xì)胞中，中間絲蛋白與微管、微絲一起共同組成平滑肌的細(xì)胞三大骨架，長期以來中間絲蛋白網(wǎng)被認(rèn)為只是維持機(jī)械完整性的固定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然而目前的研究認(rèn)為中間絲細(xì)胞

7、骨架是一個動態(tài)的信號平臺，其生物學(xué)功能涉及細(xì)胞生長、分化及其它生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。動物模型表明中間絲蛋白是維持細(xì)胞構(gòu)架及細(xì)胞機(jī)械完整性所必需的細(xì)胞骨架，它為細(xì)胞提供了一個柔韌的胞漿結(jié)構(gòu)，使其可以耐受外界的不同刺激，中間絲蛋白功能的減弱引起細(xì)胞過度脆弱不能承受各種不同的生理刺激，可以導(dǎo)致多種遺傳性疾病。靜脈曲張病人中Desmuslin表達(dá)的下調(diào)是否導(dǎo)致了平滑肌細(xì)胞的功能的變化從而導(dǎo)致原發(fā)性靜脈壁薄弱及靜脈曲張的發(fā)生呢？
　　 本研究

8、是第一個通過比較體外培養(yǎng)靜脈曲張病人及正常大隱靜脈病人的平滑肌細(xì)胞全面評估平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究，且本研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Desmuslin在正常大隱靜脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)后觀察平滑肌細(xì)胞表型及功能的變化，從而探討Desmuslin與靜脈曲張發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。本研究是對前期研究篩選出來的靜脈曲張差異表達(dá)基因Desmuslin功能學(xué)的研究。在本研究中，我們假設(shè)靜脈曲張病人血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)在生物學(xué)行為的改變是導(dǎo)致靜脈曲張發(fā)生的始發(fā)

9、因素，而我們發(fā)現(xiàn)靜脈曲張病人的平滑肌細(xì)胞具有的內(nèi)在特性包括增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的合成功能的增強(qiáng)有利于靜脈曲張的形成，而Desmuslin的低表達(dá)可以導(dǎo)致正常平滑肌細(xì)胞表型及功能發(fā)生類似曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞的改變。因此我們認(rèn)為在靜脈曲張的病人中由于Desmuslin的低表達(dá)，導(dǎo)致其中膜平滑肌細(xì)胞的內(nèi)在生物學(xué)特性的改變，不僅導(dǎo)致靜脈壁主動張力維持障礙，而且由于影響了細(xì)胞外基質(zhì)的周轉(zhuǎn)，導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)的紊亂，也影響了靜脈壁被動張力的維持，

10、最終導(dǎo)致原發(fā)性的靜脈壁薄弱及靜脈曲張的形成。
　　 第一部分、體外培養(yǎng)曲張靜脈平滑肌細(xì)胞與正常靜脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的區(qū)別
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過比較體外培養(yǎng)的正常靜脈源性的平滑肌細(xì)胞與曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為，探討靜脈中層平滑肌細(xì)胞在靜脈曲張發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 1.分別收集原發(fā)性大隱靜脈曲張病人的大隱靜脈及無靜脈曲張病人的正常大隱靜脈，然后用貼塊法進(jìn)行曲

11、張靜脈源性平滑肌細(xì)胞及正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并通過細(xì)胞形態(tài)及肌動蛋白免疫熒光染色法鑒定平滑肌細(xì)胞的純度。
　　 2.分別利用臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法及氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷酸([3H]-Thymdine)摻入法比較兩組平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 3.利用劃痕實驗比較兩組平滑肌細(xì)胞的遷移能力。
　　 4.利用免疫印跡技術(shù)比較兩組細(xì)胞收縮表型依賴標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　 5.利用氚標(biāo)記的脯氨酸([3H]-P

12、roline)摻入法比較兩組細(xì)胞總膠原的合成。
　　 6.利用酶聯(lián)免疫粘附實驗及免疫印跡技術(shù)分別檢測培養(yǎng)基內(nèi)及細(xì)胞層內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的濃度。
　　 7.采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗，各檢驗過程均以P≤0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.貼塊法培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞鏡下可見明顯特征性“峰-谷”樣生長。肌動蛋白免疫熒光法

13、鑒定平滑肌細(xì)胞及其純度，肌動蛋白染色陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的90％以上。
　　 2.在生長曲線的第5-7天，曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞增殖明顯高于正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞，平臺期時，曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞計數(shù)為正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞計數(shù)的1.5倍。同代數(shù)的兩組平滑肌細(xì)胞相比曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞經(jīng)10％FBS刺激48h后DNA的合成約為正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞的1.7倍。
　　 3.曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞比正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞

14、表現(xiàn)出增強(qiáng)的遷移能力，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)約為正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞的2.8倍。
　　 結(jié)論：
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的正常靜脈源性的平滑肌細(xì)胞與曲張靜脈源性的平滑肌細(xì)胞在表型和功能上確有不同，曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的增殖、遷移、合成功能及明顯降低的收縮表型依賴性標(biāo)志蛋白表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)表明靜脈曲張病人的平滑肌細(xì)胞具有內(nèi)在的生物學(xué)特性，而正是這種特性有利于靜脈曲張的形成。
　　 第二部分、Des

15、muslin下調(diào)對平滑肌細(xì)胞表型的影響
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Desmuslin在正常大隱靜脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察Desmuslin蛋白表達(dá)下調(diào)后平滑肌細(xì)胞表型及功能的變化，從而推斷該蛋白與靜脈曲張發(fā)生及發(fā)展中的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Desmusiin基因在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，并利用RT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。<

16、br>　　 2.利用Western blot比較下調(diào)Desmuslin基因的表達(dá)后平滑肌細(xì)胞收縮表型依賴標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　 3.利用[3H]-Proline摻入法比較下調(diào)Desmuslin的表達(dá)后總膠原的合成。
　　 4.分別利用酶聯(lián)免疫法及Western blot比較下調(diào)Desmuslin的表達(dá)培養(yǎng)基內(nèi)及細(xì)胞層內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的含量。
　　 5.免疫熒光染色法比較下調(diào)Desmuslin表

17、達(dá)后平滑肌肌動蛋白骨架的變化。
　　 6.采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間的比較用單因素方差分析，兩組之間的比較用配對t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 結(jié)論：
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在正常血管平滑肌細(xì)胞中下調(diào)Desmuslin的表達(dá)后，正常靜脈源性平滑肌細(xì)胞發(fā)生像曲張靜脈源性平滑肌細(xì)胞一樣去分化的改變，收縮表型標(biāo)志性蛋白明顯下調(diào)及