銅綠假單胞菌院內(nèi)感染的防控策略——耐藥性及免疫原性研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，在醫(yī)院獲得性感染中較為常見。PA耐藥機制較為復(fù)雜，其中整合子特別是Ⅰ類整合子介導(dǎo)的多重耐藥機制正日益引起人們的重視。由于PA對多種抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性多重耐藥，其所致感染可供選擇的有效抗菌藥物甚少，使得臨床治療的難度大為增加。這種狀況已使抗生素治療PA感染面臨困境，這一方面促使人們不斷更新和研制新型抗生素，尋求有效的治療方案；另一方面激發(fā)人

2、們尋找新型廣譜疫苗，提高易感人群的特異性抗感染免疫能力，避免PA感染帶來的困窘。本研究基于鎮(zhèn)江地區(qū)PA的耐藥狀況，利用信號接頭分子MyD88對病原刺激信號的細(xì)胞內(nèi)傳遞作用，研制廣譜、高效的PA核酸疫苗。 目的:(1)了解分離于鎮(zhèn)江地區(qū)的PA對十三種常用抗生素的耐藥狀況，明確Ⅰ類整合子基因盒結(jié)構(gòu)及其在耐藥基因播散中的作用。 (2)原核表達(dá)PA外膜蛋白OPrF建立檢測抗PA抗體的ELISA方法，以用于判斷本研究所制備的疫苗效

3、果。 (3)研制PA OprF表位核酸疫苗，利用MyD588的佐劑作用增強免疫應(yīng)答。 方法:(1)采用K-B紙片法檢測71株P(guān)A的耐藥率；煮沸法提取71株P(guān)A基因組DNA；PCR擴增Ⅰ類整合子基因；測序分析其所攜帶的耐藥基因盒；脈沖場電泳分析優(yōu)勢攜帶Ⅰ類整合子的PA菌株間的關(guān)系。 (2)SDS-蛋白酶K提取PA基因組DNA，并以此為模板擴增OprF基因，T-A克隆后將此基因插入PET-32(a)載體，構(gòu)

4、建重組載體PET-32(a)-OprF，在E. coli BL21中表達(dá)，用Ni-NTA層析柱純化目的蛋白。將純化蛋白包被ELISA板，建立檢測PA抗體的ELISA檢測方法，為疫苗免疫機體產(chǎn)生抗體效果的檢測奠定基礎(chǔ)。 (3)優(yōu)選PAOprF的三個中和性B細(xì)胞表位，并將此三表位及一個外源通用T細(xì)胞表位串聯(lián)，表位之間用賴氨酸間隔，再采用大腸埃希菌的優(yōu)勢密碼子，將上述構(gòu)建的疫苗的氨基酸序列轉(zhuǎn)換為DNA序列。采用重疊PCR方法合成全基因，并在此

5、序列前插入組織型纖溶酶原(tPA)的信號肽基因，將此獲得的片段與MyD88基因同時連接到雙表達(dá)載體pIRES中，構(gòu)建pIRES-tPA-OprF：MyD88重組質(zhì)粒。通過PCR、酶切及序列測定進(jìn)行鑒定。將pIRES-tPA-OprF：MyD88重組質(zhì)粒免疫Balb/c小鼠，ELISA法檢測血清特異性抗體水平。建立小鼠肺部感染PA動物模型，通過檢測各組小鼠血清中特異性抗體水平、鼠肺細(xì)菌計數(shù)等，判斷研制的PA核酸疫苗的免疫效果和對受染小鼠的

6、保護(hù)作用。 結(jié)果:(1)71株P(guān)A對臨床常用的13種抗生素的耐藥率在18.3％～77.5％不等；Ⅰ類整合子檢出率為38％，包括aadB、aac(6')-Ⅱ、PSE-ⅠdfrA17和aadA5五種基因盒，其中最常見者為dfrA17和aadA5。Ⅰ類整合子陽性菌株對哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等10種抗生素的耐藥率明顯高于整合子陰性菌株。PFGE分析2

7、2株攜帶1.6kb Ⅰ類整合子的PA流行規(guī)律。 (2)擴增得到OprF基因，編碼區(qū)cDNA的全長459 bp，編碼153個氨基酸殘基，與GenBank中發(fā)表的序列完全一致。將OprF基因克隆到pET32a原核表達(dá)載體，獲得重組載體PET-32(a)-OprF。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli M15，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，Ni-NTA層析柱純化獲得目的蛋白。將純化蛋白包被ELISA板，建立了PA抗體檢測方法。 (3)構(gòu)建了PA表位

8、核酸疫苗，體內(nèi)試驗證實，小鼠血清中特異性抗體水平較高，對PA的感染具有免疫保護(hù)。 結(jié)論:(1)不同PA臨床株對十三種常用抗生素的耐藥率各不相同，整合子陽性菌株耐藥率明顯高于整合子陰性菌株，提示Ⅰ類整合子是PA多重耐藥的重要因素。 (2)成功克隆了OprF基因并獲得原核表達(dá)蛋白，重組蛋白具有較強的免疫原性，用其免疫動物獲得較高效價的特異性抗體，并以此建立了PA抗體ELISA檢測方法和成功用于PA核酸疫苗效果評價。