氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥性及分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　細(xì)菌耐藥性是當(dāng)今世界所面臨的緊迫公共衛(wèi)生問題之一，抗菌藥物的大量應(yīng)用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐年增加的主要因素。WHO的調(diào)查顯示，耐藥細(xì)菌幾乎分布于全球的各個(gè)地區(qū)，2015年3月27日美國公布抗擊耐藥細(xì)菌國家行動計(jì)劃。本文所研究的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，是近年來心內(nèi)科植入手術(shù)（支架、起搏器）患者術(shù)后感染的主要病原菌。假單胞菌屬的代表菌株就是PA，是一種條件致病菌，在人的呼吸道、腸

2、道、和皮膚等都有該菌存在,易導(dǎo)致醫(yī)院感染的發(fā)生。近年來我國衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，銅綠假單胞菌排名處于院內(nèi)感染病原菌的前四位，在呼吸道分離的病原菌中，銅綠假單胞菌位居首位。近年來由于廣譜抗菌藥物的大量使用，致使PA對國內(nèi)常用抗菌藥物的敏感性逐年下降，多重耐藥和泛耐藥PA的分離率日漸增高，成為院內(nèi)嚴(yán)重的化膿性感染，尤其是敗血癥、肺膿腫、慢性支氣管炎、內(nèi)植物手術(shù)（心臟介入手術(shù)、人工關(guān)節(jié)植入手術(shù)）后引起感染等重要的致病菌，由于PA耐藥機(jī)制

3、復(fù)雜，治愈其引起的感染對臨床醫(yī)生來說是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
　　近20年來抗菌藥物喹諾酮類的發(fā)展十分迅速，由于該類藥物的劑型多、使用方便、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，常常被國內(nèi)外臨床醫(yī)生用于控制由病原體引起的感染性疾病中。因此，細(xì)菌對喹諾酮類藥物的敏感性呈下降趨勢，對該類抗菌藥物耐藥病原菌的種類不斷增多。研究證實(shí)PA對喹諾酮類藥物敏感性下降的主要機(jī)制為：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，Ⅳ基因突變；主動外排系統(tǒng)的調(diào)控基因高表達(dá)而致細(xì)菌主動外排能力增強(qiáng)；生

4、物膜的形成和細(xì)菌外膜通透性改變。幾種耐藥機(jī)制單獨(dú)或共同作用引起PA對喹諾酮藥物的耐藥性增加。但是，PA對喹諾酮類藥物耐藥性與喹諾酮類藥物使用時(shí)間、劑量之間的相關(guān)性、耐喹諾酮藥物PA的耐藥特點(diǎn)以及臨床在應(yīng)用喹諾酮藥物的周期內(nèi)對喹諾酮藥物敏感的PA對其耐藥機(jī)制的變化尚不十分清楚。
　　目的：
　　深入了解我院內(nèi)科系統(tǒng)PA感染情況和對喹諾酮藥物耐藥性流行狀況，提供可經(jīng)驗(yàn)用于本地區(qū)PA感染的抗菌藥物。研究PA對喹諾酮藥物耐藥性與喹諾

5、酮類藥物使用劑量和使用周期之間的相關(guān)性、耐喹諾酮藥物PA的耐藥特點(diǎn)和具體機(jī)制，以及臨床在應(yīng)用喹諾酮藥物的周期內(nèi)對喹諾酮藥物敏感的PA產(chǎn)生耐藥機(jī)制的變化，為臨床推薦適合喹諾酮藥物治療PA感染的藥物劑量和使用周期，對預(yù)防和控制醫(yī)院感染給予指導(dǎo)。
　　方法：
　　1．所有病原菌的原始數(shù)據(jù)輸入WHONET5.4軟件，使用該軟件統(tǒng)計(jì)PA的標(biāo)本分布和耐藥率；各種藥物的 DDD值來源于衛(wèi)生部抗菌藥物臨床應(yīng)用監(jiān)測網(wǎng)藥品字典，DDDs=某抗菌

6、藥年消耗量( m)／該藥的DDD值，本研究抗菌藥物的使用頻度（DBD）用 DDDs/100bed-days表示；研究抗菌藥物使用與其耐藥性間的關(guān)系使用斯皮爾曼相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。分析不同標(biāo)本中分離出的 PA對常用抗菌藥物耐藥率之間的差異，使用ANOVA中的LSD（最小顯著差異法）。
　　2．使用瓊脂稀釋法測定MIC值；PCR擴(kuò)增拓?fù)洚悩?gòu)酶基因（gyrA、gyrB、parC和parE），純化，測序；通過RT-PCR分析4種外排系統(tǒng)膜

7、連接蛋白MexA、MexC、MexE和MexX表達(dá)量；使用χ2檢驗(yàn)分析基因突變和外排泵表達(dá)與耐藥性之間的關(guān)系。
　　3．采用 CIP、LEV和 NOR的梯度濃度(0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC)MH肉湯與臨床分離的7株銅綠假單胞菌分別進(jìn)行體外培養(yǎng)；采用E-test法和瓊脂稀釋法測定誘導(dǎo)后菌株的MIC值；PCR擴(kuò)增Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因，純化，測序；RT-PCR分析4種外排系統(tǒng)膜連接蛋白MexA、MexC、MexE和MexX

8、基因的表達(dá)量；使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS16.0，對誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后 MIC值的比較采用 t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析（LSD），檢驗(yàn)三種不同濃度梯度抗菌藥物誘導(dǎo)后，銅綠假單胞菌MIC值的差別。以p<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4．采用結(jié)晶紫染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究在體外與三種喹諾酮藥物不同濃度（0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC）誘導(dǎo)后銅綠假單胞菌生成生物膜能

9、力的差別，采用單因素方差分析PA與三種不同濃度梯度抗菌藥物誘導(dǎo)后生物膜形成能力的差別。以p<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．我院PA在內(nèi)科患者中主要以呼吸道感染為主，占55.2％，呼吸道感染的PA對抗菌藥物耐藥率高于其它部位感染的該菌，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.05；九年間醫(yī)院PA對阿米卡星的耐藥率最低，2010年為6.3%；對頭孢他啶的耐藥率均保持在30%以下，其次為環(huán)丙沙星；但總體對所監(jiān)測其它抗菌藥物的

10、敏感性較低。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星）和碳青霉烯類藥物（亞胺培南、美羅培南）的用量與PA對其的耐藥率呈正相關(guān)，p≤0.05。
　　2．臨床呼吸道分離的150株P(guān)A，對環(huán)丙沙星的耐藥率最低為28.8%，對莫西沙星的耐藥率最為嚴(yán)重，耐藥率為96.3%,對左氧氟沙星和氧氟沙星次之，所分離菌株中有38株P(guān)A同時(shí)對所研究5種氟喹諾酮藥物均耐藥。
　　3．38株對氟喹諾酮藥物耐藥PA中26株存在gyrA亞單位Th

11、r83→Ile突變，3株有parC亞單位Ser80(TCG)-Ieu(TTG）突變，4株由于parC亞單位38位堿基的缺失，導(dǎo)致氨基酸的連續(xù)突變，未發(fā)現(xiàn)gryB和parE基因QRDR區(qū)的突變株； gyrA基因突變組與未突變組對CIP（p<0.05），LEV（p<0.001）的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對NOR（p>0.05）的敏感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4．通過比較在加入和不加外排泵抑制劑PAβN兩種處理?xiàng)l件測得的MIC值，篩選出外排泵

12、高表達(dá)表型陽性的菌株共9株，陽性率為23.7%（9/38）；RT-PCR擴(kuò)增后，有6株P(guān)A外排基因mexA高表達(dá)。外排基因MexE高表達(dá)的菌株有2株。未發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)外排基因MexC和MexX的菌株。
　　5．7株P(guān)A與CIP、LEV和NOR不同濃度（0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC）共同培養(yǎng)后，PA對CIP的MIC值的變化是原菌株的2.5-160倍，對NOR的MIC值的變化是原菌株的4-32倍，對LEV的MIC的變化是

13、原菌株的1-64倍； LSD統(tǒng)計(jì)分析，藥物濃度為4MIC時(shí)對三種氟喹諾酮類藥物MIC值影響與0.5MIC、1MIC和2MIC有差異， p<0.05。NOR和LEV在藥物濃度為2MIC和4MIC時(shí)對誘導(dǎo)菌株MIC值有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05；CIP與LEV和NOR之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05。
　　6．三種氟喹諾酮藥物不同濃度誘導(dǎo)后 PA，經(jīng) PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物純化后的測序，其結(jié)果與GenBank中PAO1的相應(yīng)序列進(jìn)行比對

14、，在GryA亞單位的突變主要為83Thr-Gla（10株），72Asp-Gly（3株），87Asp-Asn（1株）；4株有 parC基因QRDR區(qū)發(fā)生80位氨基酸密碼子發(fā)生突變Ser80(TCG)-Ieu(TTG）；未發(fā)現(xiàn)在GryA和ParC的QRDR的其它突變；外排基因MexC高表達(dá)的菌株占所有研究菌株的98.8%，其次為MexX高表達(dá)的菌株45.23%，MexE高表達(dá)的菌株為26.19%。未發(fā)現(xiàn)有MexA的高表達(dá)株。
　　7．

15、結(jié)晶紫染色后，使用SM-Mk3酶標(biāo)儀在570nm單波長下測吸光值。在所測菌株中A570<0.3占39.29%；0.31.0占12.50%；差異性分析藥物對不同菌株生物膜生成量之間（F=2.202，p=0.116），提示不同氟喹諾酮類藥物之間對臨床分離7株銅綠假單胞菌生物膜的生成無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05；差異性分析不同濃度之間的氟喹諾酮藥物對生物膜生成能力有顯著差異（p=0.000)。使用最小顯

16、著差數(shù)法（LSD）分析,0.5MIC誘導(dǎo)后的臨床分離株對生物膜生成能力的影響與1MIC、2MIC和4MIC誘導(dǎo)后的菌株有顯著差異p=0.000，而其余三個(gè)濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05。
　　8．對實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)A生物膜的觀察分別在24h、48h、72h并采集圖像，未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的對照菌株生物膜形成在相同的觀察時(shí)間點(diǎn)上晚于經(jīng)過藥物誘導(dǎo)的菌株，在72h鏡下可見菌株仍疏松，經(jīng)過LEV誘導(dǎo)的菌株在24h菌落已聚集成較大的片狀生物膜，形成速度

17、要高于CIP誘導(dǎo)的菌株。0.5MIC誘導(dǎo)后的菌株形成生物膜明顯強(qiáng)于4MIC誘導(dǎo)后的菌株。
　　結(jié)論：
　　1．PA耐藥率變化與氟喹諾酮藥物、碳?xì)涿瓜╊愃幬锸褂昧康脑黾映烧嚓P(guān)；阿米卡星，頭孢他啶、環(huán)丙沙星可作為治療PA的經(jīng)驗(yàn)用藥；
　　2．氟喹諾酮藥物耐藥的PA以GyrA亞單位Thr83（ACC）→Ile（ATC）突變和外排基因mexA高表達(dá)為主；本研究在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)parC亞單位38位堿基的缺失，使相應(yīng)氨基酸的錯(cuò)譯，