下調PTEN對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響及其機制的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是由腦血管疾病引起的腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合癥，以記憶、認知功能缺損為主，所以有效改善患者的學習記憶功能是血管性癡呆研究的重點和突破點所在。第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現下調PTEN

2、表達對神經元有保護作用，且作為PI3K/Akt信號通路的關鍵負性調節(jié)因子，PTEN在神經元分化、樹突分枝及突觸可塑性方面也可發(fā)揮重要作用。因此，預測將其下調有可能參與改善VD大鼠的學習記憶能力。本課題利用PTEN特異性RNAi（RNA interference，RNA干擾）的重組腺病毒載體，轉染血管性癡呆大鼠模型，選擇與學習記憶相關的轉錄因子環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element-bindingprote

3、in，CREB）為切入點，觀察PTEN基因沉默對癡呆海馬區(qū)的病理改變、CREB表達變化以及學習記憶能力的改善，闡明PTEN在血管性癡呆突觸可塑性及學習記憶中的重要作用，以期為臨床血管性癡呆的基因治療奠定基礎。
　　 方法：
　　 1.應用人胚腎293細胞擴增PTEN特異性RNAi的重組腺病毒AdR-siPTEN，采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化病毒并測定其滴度；
　　 2.分別用適當劑量的重組腺病毒和空病毒（陰性

4、對照）轉染缺血癡呆大鼠海馬組織，熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達，RT-PCR及Western blotting檢測腺病毒轉染后PTEN基因表達下降情況，探明RNAi對PTEN的抑制效率；
　　 3.40只SD大鼠隨機分為缺血癡呆組（VD組），假手術組和腺病毒處理組（siPTEN組），陰性對照組（AdRFP組）。4周后分別應用水迷宮、HE和Nissl染色檢測各組大鼠行為學及組織病理形態(tài)學變化，觀察下調PTEN對癡呆大鼠學習記憶功

5、能的影響；
　　 4.應用RT-PCR及免疫組化分別從mRNA和蛋白水平檢測。PTEN表達下調后海馬區(qū)Akt、CREB表達的變化，探討下調PTEN對血管性癡呆大鼠海馬神經元CREB表達的影響，從而探討PTEN基因改善缺血癡呆大鼠學習記憶功能的分子機制。
　　 結果：
　　 1.重組腺病毒轉染293細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到明確的紅色熒光，擴增并純化后AdR-siPTEN的滴度為：3.36x1010 pfu/ml

6、；AdRFP的滴度為：2.98×1010pfu/ml。
　　 2.轉染腺病毒一定時限后，大鼠海馬組織均出現紅色熒光蛋白陽性表達；RT-PCR和Western blot結果顯示：與假手術組相比，缺血癡呆后，PTEN mRNA和蛋白水平明顯增高（p<0.01），腺病毒干預后PTEN mRNA和蛋白表達水平下調（p<0.01），而陰性對照組中PTEN表達無明顯變化（p>0.05）；
　　 3.水迷宮檢測發(fā)現缺血癡呆后大鼠逃避潛

7、伏期明顯延長，跨越平臺次數顯著減少，經siPPTEN處理后延長的逃避潛伏期縮短，減少的跨越平臺次數增多（P<0.01）；與AdRFP組比較，siPTEN組逃避潛伏期也明顯縮短，跨平臺次數顯著增多（P<0.01）；Nissl染色顯示，siPTEN組海馬神經元損傷程度明顯輕于VD和AdRFP組大鼠；HE染色后光鏡下觀察，siPTEN組海馬變性程度較VD和AdRFP組明顯減輕，其結果與Nissl染色結果相吻合；
　　 4.RT-PCR

8、及免疫組化分別檢測CREB mRNA基因表達和蛋白水平結果均顯示：siPTEN組海馬部位CREB水平較AdRFP組明顯升高，但未至正常水平（p<0.01），表明siPTEN組大鼠空間學習記憶障礙得到改善可能與海馬區(qū)CREB表達升高有關。
　　 結論：
　　 1.采用293細胞成功擴增了大量重組腺病毒AdR-siPTEN以滿足后續(xù)實驗的需要。
　　 2.腺病毒能高效感染海馬組織，有效進行PTEN特異性siRNA基因