神經(jīng)生長因子降鈣素基因相關(guān)肽在下頜骨骨缺損愈合時調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、因外傷、腫瘤、先天性畸形等造成頜骨缺損的修復(fù)一直是困擾口腔頜面外科臨床醫(yī)生的難題。頜骨缺損一方面造成功能障礙，另一方面造成美觀問題，加重患者的心理負(fù)擔(dān)。隨著社會的進(jìn)步和發(fā)展，交通事故的發(fā)生機(jī)會也越來越多，頭面部損傷和頜骨骨折的發(fā)生率呈增高趨勢?，F(xiàn)代戰(zhàn)爭中，面部缺乏防護(hù)，頜面部現(xiàn)代戰(zhàn)傷發(fā)生率超出10％。因此，有關(guān)頜骨骨缺損修復(fù)的研究也一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點問題。
　　 骨缺損的修復(fù)中，神經(jīng)系統(tǒng)在其中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。我們的

2、前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)介質(zhì)在修復(fù)的啟動、成骨和后期改建中均發(fā)揮重要作用，有許多細(xì)胞因子參與這一過程。分子生物學(xué)研究表明，骨折愈合是一個多種細(xì)胞生長因子參與調(diào)控的復(fù)雜過程，這其中既有骨缺損周圍成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用，也有遠(yuǎn)端相關(guān)器官通過體液轉(zhuǎn)運而來的各種激素和調(diào)節(jié)因子，還有神經(jīng)系統(tǒng)通過神經(jīng)末梢釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)參與其中。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactor；n

3、eurotrophic factors，NTF)，的一種，也是骨缺損周圍成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。研究表明，NGF對骨缺損愈合過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)作為重要的感覺神經(jīng)信號分子，因在骨折愈合調(diào)控中的重要作用而受到廣泛關(guān)注。NGF與CGRP都與骨缺損愈合過程相關(guān)，并且國內(nèi)外諸多研究發(fā)現(xiàn)CGRP和NGF骨折區(qū)的含量均增多。而且都與支配骨組織的神

4、經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)，不同在于NGF是神經(jīng)靶細(xì)胞分泌，被神經(jīng)末梢攝取的，CGRP是神經(jīng)末梢釋放的，作用于靶細(xì)胞的。這兩者在骨愈合過程中的相互關(guān)系如何?有沒有相互之間的調(diào)節(jié)機(jī)制?
　　 基于以上想法，并結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展，本課題首先制備可以在骨缺損區(qū)域持續(xù)釋放NGF的緩釋微球，研究下頜骨骨缺損愈合過程中NGF對支配下頜骨的三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP的合成與分泌的影響。利用藥劑學(xué)技術(shù)，制備單甲氧基聚乙二醇聚乳酸神經(jīng)生長因子[(mono-metho

5、xy poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid)-nerve growth factor，mPEG-PLA-NGF]緩釋微球，檢測微球的包封率、載藥量等理化性質(zhì)，研究緩釋微球的體外釋放規(guī)律。利用PC-12細(xì)胞培養(yǎng)實驗，檢測微球釋放NGF的生物活性和臨床實際應(yīng)用價值。制備大鼠下頜骨骨缺損模型，通過全身注射或局部應(yīng)用NGF緩釋微球干預(yù)骨愈合過程，檢測大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)NGF、CGRP、TrkA(tyrosi

6、ne kinase A，絡(luò)氨酸激酶A)等的變化，探討下頜骨骨缺損愈合過程中NGF對神經(jīng)節(jié)的作用。原代培養(yǎng)大鼠的成骨細(xì)胞，并進(jìn)行形態(tài)觀察和鑒定，用不同濃度的CGRP刺激成骨細(xì)胞，觀察CGRP對成骨細(xì)胞合成NGF的影響
　　 實驗方法和結(jié)果：
　　 1、mPEG-PLA-NGF緩釋微球的制備及體外釋放實驗研究
　　 mPEG-PLA-BSA微球的制備預(yù)實驗：取三種不同配比的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(mono-metho

7、xy poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid)，mPEG-PLA)(mPEG：PLA分別為1:4，1:10，1:20的3種mPEG-PLA，其中mPEG分子量均為5000。)用復(fù)乳法制備微球，通過篩選，選用mPEG：PLA=1:20的mPEG-PLA。用復(fù)乳法制備mPEG-PLA-NGF緩釋微球，觀察微球的表面形態(tài)，微球表面光滑圓整，球體大小較均勻。微球平均粒徑為74.2±21.3μm，粒徑分布范圍

8、較窄。載藥量和包封率的實驗表明，mPEG-PLA-NGF緩釋微球包封率為(77.3±1.81)％。載藥量為[(2.13±0.24.)×10-5]％。微球的體外釋放實驗表明，微球在14d內(nèi)，不僅一直持續(xù)釋放神經(jīng)生長因子，而且所釋放出的神經(jīng)生長因子濃度可以保持在一定的水平：(54.67-76.81)fmol/μL，平均濃度為(65.74±11.07)fmol/μL。經(jīng)檢測表明，神經(jīng)生長因子緩釋微球的24h內(nèi)釋放量為27.36％，21d后釋放

9、度達(dá)72.34％。NGF緩釋系統(tǒng)中釋放的NGF活性測定試驗中，通過PC-12細(xì)胞的出芽情況證明了mPEG-PLA-NGF緩釋微球可以持續(xù)釋放出有生理活性的NGF。
　　 2、神經(jīng)生長因子在下頜骨骨缺損愈合過程中對骨折愈合的促進(jìn)作用以及對三叉神經(jīng)節(jié)合成降鈣素基因相關(guān)肽的影響
　　 建立大鼠下頜骨骨缺損動物模型，分為：①空白組：只手術(shù)，不給藥；②對照組：手術(shù)后，NGF腹腔給藥；③實驗組：手術(shù)時，局部涂布mPEG-PLA-NG

10、F緩釋微球。分別在術(shù)后1w，2w，4w，8w處死動物。術(shù)區(qū)標(biāo)本HE染色顯示，mPEG-PLA-NGF實驗組的骨痂生成量和骨痂成熟度要明顯高于對照組和空白組，而且愈合時間明顯提前。四環(huán)素?zé)晒馊旧Y(jié)果顯示，mPEG-PLA-NGF實驗組可加快大鼠新生骨的形成，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 建立大鼠下頜骨骨缺損動物模型，分為：①單純骨缺損組，不給藥；②單純?nèi)斫o藥組，不手術(shù)；③骨缺損+全身給藥組；④骨缺損+NGF微球；⑤空白組。在術(shù)后第1

11、d，2d，3d，7d處死動物，獲取三叉神經(jīng)節(jié)標(biāo)本，并通過免疫組化法，檢測三叉神經(jīng)節(jié)中NGF、CGRP、TrkA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，各組均觀察到三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)NGF、CGRP、TrkA表達(dá)有所增強(qiáng)，第2組最不明顯，第4組表達(dá)顯著高于其他組。3天達(dá)到最高，以后逐漸下降，但仍高于兩對照組。三項指標(biāo)結(jié)果極為相似，顯示出密切的相關(guān)性。
　　 3、降鈣素基因相關(guān)肽對成骨細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子的影響
　　 原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，并進(jìn)行了

12、形態(tài)觀察和鑒定。用不同濃度的CGRP刺激成骨細(xì)胞，在第1，2，3，5d，用ELISA法測不同濃度CGRP對大鼠成骨細(xì)胞上清液中NGF濃度的影響。結(jié)果顯示成骨細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的NGF，在CGRP作用下，可以明顯上調(diào)成骨細(xì)胞分泌的NGF，而且隨CGRP濃度升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外，成骨細(xì)胞上清液中NGF的濃度隨CGRP作用后時間延長也增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、以mPEG-PLA為載體，采用復(fù)乳法(w/o/w)制

13、備的mPEG-PLA-NGF緩釋微球具有良好的物理和生化性能，能夠持續(xù)釋放具有生物活性的神經(jīng)生長因子。
　　 2、實驗采用的微球制備方法和工藝確實可行，并具有一定的實用性。通過中國、美國、歐盟、日本等專利檢索，“一種生長因子緩釋微球及其制備方法”具有原創(chuàng)性，已經(jīng)獲得了中國知識產(chǎn)權(quán)局技術(shù)發(fā)明專利(專利號：ZL201110027337.8)。
　　 3、體內(nèi)實驗表明骨缺損區(qū)域的NGF能夠促進(jìn)大鼠下頜骨骨缺損的愈合，促進(jìn)大鼠的