聚陽離子納米復合物在白癜風模型中抗黑素細胞凋亡作用的研究.pdf

1、白癜風(vitiligo)是一種由于黑素細胞特異性損害而致色素脫失的獲得性皮膚病，由皮膚和毛囊的黑素脫失引起，是一種容易診斷而難于治療的皮膚病，其病因和發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。近期研究發(fā)現(xiàn)，黑素細胞生長存活缺陷是白癜風皮損中黑素細胞丟失的一個主要原因，因此抑制黑素細胞凋亡是白癜風治療的一個潛在重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)，在黑素細胞中，Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白，而Bax(Bal-2associated X protein，Bcl-2相關蛋白

2、X)則是主要的促凋亡蛋白，易感個體Bcl-2的表達降低或Bax過度表達均可能導致白癜風的發(fā)生。因此，靶向調(diào)節(jié)黑素細胞中Bcl-2與Bax的表達平衡可能有效地控制黑素細胞凋亡，從而為白癜風的治療提供一條新的思路。
　　 本課題組前期構(gòu)建了靶向于黑素細胞的聚陽離子基因納米復合物給藥系統(tǒng)P123-PEI-MSH/Bax/iRNA，即依靠α-黑素細胞刺激素(α-MSH)與黑素細胞表面的黑皮素-1受體(MC-1R)的特異性結(jié)合作用，以聚乙

3、烯亞胺(PEI)為基因載體，利用RNA干擾/DNA表達的雙向基因調(diào)控技術(shù)，將小干擾RNA片段/質(zhì)粒DNA包裹于上述基因載體中，在抑制Bax過表達的同時促進Bcl-2表達。體外研究證實靶向于黑素細胞的納米給藥系統(tǒng)P123-PEI-MSH/Bax/iRNA，具有高靶向性、低毒性等優(yōu)良特性，能顯著促進黑素細胞增殖的優(yōu)勢。
　　 本課題研究目標是利用化學脫色法構(gòu)建白癜風動物模型并加以驗證;將利用小RNA干擾Bax/過表達Bcl-2的雙向

4、基因調(diào)控技術(shù)制備的靶向藥物作用于白癜風小鼠模型，驗證其抗黑素細胞凋亡作用，并探索小RNA干擾片段和過表達質(zhì)粒的最佳比例，進一步為白癜風患者提供一條理想的治療途徑。
　　 第一部分白癜風動物模型的構(gòu)建及模型評價
　　 [研究目的]:構(gòu)建白癜風動物模型，為進一步藥效研究奠定基礎。
　　 [研究方法]:運用化學脫色法。以C57小黑鼠為實驗模型，在其背部取2cm×2cm區(qū)域脫毛，空白組背部無毛區(qū)涂抹蒸餾水0.7ml，一天

5、2次，連續(xù)50天;模型組背部無毛區(qū)涂抹5％過氧化氫溶液0.7ml，一天2次，連續(xù)50天。拍照記錄小鼠皮膚顏色變化。造模結(jié)束后，肉眼觀察小鼠皮膚及毛發(fā)顏色變化情況;分別隨機取兩只空白組及模型組小鼠，頸椎脫臼處死，取受試區(qū)皮膚行黑素細胞染色法（Dopa染色法）觀測黑素細胞數(shù)量變化。
　　 [結(jié)果]:肉眼觀察模型組小鼠皮膚明顯變白，部分出現(xiàn)白斑，部分原有黑毛處長出白毛;空白組無變化。
　　 Dopa染色后鏡下觀察模型組小鼠黑素

6、細胞數(shù)目較空白組明顯減少。
　　 [結(jié)論]:通過5％過氧化氫化學脫色法構(gòu)建的小鼠動物模型在臨床上可較好的模擬白癜風。
　　 第二部分抗黑素細胞凋亡作用研究
　　 [研究目的]:研究P123-PEI-MS H/Bax/iRNA對白癜風小鼠黑素細胞凋亡的影響，并研究小RNA干擾片段和過表達質(zhì)粒的最佳比例。
　　 [研究方法]:每組隨機選取10只小鼠，分組及用藥情況如下:
　　 Ⅰ組—正常對照組;

7、>　　 Ⅱ組—模型對照組;
　　 Ⅲ組—陽性對照組，外用0.1％他克莫司軟膏，每天一次，連續(xù)20天;
　　 Ⅳ組—給藥組A，涂0.5ml含藥溶液(siRNA1ug，DNA0.5ug)，每天一次，連續(xù)20天;
　　 Ⅴ組—給藥組B，涂0.5ml含藥溶液(siRNA1ug，DNA1ug)，每天一次，連續(xù)20天;
　　 Ⅵ組—給藥組C，涂0.5ml含藥溶液(siRNA1ug，DNA1.5ug)，每天一次，連續(xù)

8、20天。
　　 每組隨機選取5只小鼠，取其皮膚采用Lab色度儀測定皮膚亮度，計算亮度差值△L*=L*背部-L*腹部。
　　 取各組剩余5只小鼠皮膚，分別利用多巴染色法檢測黑素細胞數(shù)量、硫酸亞鐵染色法檢測黑素顆粒數(shù)量，并與模型對照組及陽性對照組進行比較。
　　 [結(jié)果]:通過皮膚亮度測定，與Ⅱ組（模型對照組）相比，Ⅲ-Ⅵ組小鼠皮膚的亮度差值顯著降低（P＜0.05）;且Ⅴ組、Ⅵ組皮膚亮度差值分別較Ⅲ組、Ⅳ組顯著降低（

9、P＜0.05），Ⅴ、Ⅵ組間無統(tǒng)計學差異;模型對照組皮膚亮度差值無變化。
　　 組織學觀察，Ⅲ-Ⅵ組小鼠皮膚黑素細胞及黑素顆粒數(shù)量明顯多于Ⅲ組(P＜0.05);且Ⅴ組、Ⅵ組黑素細胞及黑素顆粒明顯多于Ⅲ組、Ⅳ組（P＜0.05），Ⅴ、Ⅵ組間無統(tǒng)計學差異。
　　 [結(jié)論]:靶向作用于黑素細胞的聚陽離子基因納米復合物給藥系統(tǒng)P123-PEI-MSH/Bax/iRNA可以顯著促進有活性的黑素細胞增生，促進黑素的生成。當siRNA和D