Teff-Treg在尋常型白癜風黑素細胞破壞中的作用及其機制研究.pdf

1、白癜風是一種常見的皮膚色素脫失性疾病，因患者表皮進行性丟失功能性的黑素細胞(MC)，而表現(xiàn)為患處皮膚出現(xiàn)大小不規(guī)則的白色斑片，嚴重影響患者容貌。由于本病病因不明，發(fā)病機制復雜，目前尚無十分有效的根治方案。因此，積極探索白癜風的發(fā)病機制，尋找恰當?shù)闹委煱悬c，對最終攻克此病具有重要意義。
　　 大量研究證實，尋常型白癜風(VV)患者中存在細胞免疫功能的異常?；颊咄庵苎推ふ罹植科つw中可檢測出比例升高的MC特異性細胞毒性T淋巴細胞，同

2、時，VV患者伴發(fā)其他自身免疫病(AID)的比率明顯高于一般人群。但患者機體因何種原因喪失了對自身細胞的免疫耐受仍不得而知。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)具有免疫抑制作用，在維持機體免疫耐受中起重要作用，其數(shù)量減少和功能下降與多種AID的發(fā)生有關(guān)。初步的研究已發(fā)現(xiàn)VV患者外周血Treg的抑制功能低于正常人。那么，VV患者是否存在以Treg受損為特征的系統(tǒng)性的免疫調(diào)節(jié)機制異常，從而導致系統(tǒng)性效應T細胞(Teff)反應亢進，引起了包括MC在內(nèi)的

3、多個組織器官的免疫破壞，表現(xiàn)為VV伴發(fā)高比例的AID和變態(tài)反應性疾病(ALD)?目前國內(nèi)外仍未有系統(tǒng)而深入的闡釋。新近發(fā)現(xiàn)的炎癥性Teff亞群-輔助性T細胞(Th)17和Th22參與了多種AID的發(fā)病，但兩者在VV發(fā)病中的作用仍不清楚。VV中是否存在Teff/Treg失衡?Teff在VV患者MC功能破壞和凋亡中扮演何種角色?深入探索T細胞免疫功能對解開VV發(fā)病之謎具有十分重要的意義。
　　 本研究首先證實了在VV患者中有較高比例

4、的患者伴發(fā)其他AID和ALD，最常伴發(fā)的疾病是自身免疫性甲狀腺炎、慢性蕁麻疹、支氣管哮喘和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，提示患者存在系統(tǒng)性的免疫反應亢進。其次，我們研究了VV患者中包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、Th17和Th22在內(nèi)的Teff亞群及Treg細胞與病情進展的關(guān)系，證實了進展期患者存在Teff/Treg失衡。再次，我們研究了進展期患者體內(nèi)升高的Teff亞群相關(guān)細胞因子對體外培養(yǎng)的MC合成黑素功能的影響以及誘導細胞發(fā)生凋亡的作

5、用，發(fā)現(xiàn)干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-17和IL-22可不同程度地通過抑制MC的酪氨酸酶(TYR)和小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)mRNA的表達而對MC的黑素合成起抑制作用，另外，IFN-γ還可直接誘導MC凋亡。
　　 第一部分 VV患者伴發(fā)AID和ALD的流行病學調(diào)查
　　 目的：了解VV患者中其他AID和ALD的患病率。
　　 方法：以調(diào)查表形式收集127例VV患者的臨床資料，應用SPSS15.0軟

6、件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果：127例VV患者中20(15.75％)例伴發(fā)其他AID，27(21.26％)例伴發(fā)ALD。其中自身免疫性甲狀腺炎(13.39％)、慢性蕁麻疹(11.02％)、支氣管哮喘(6.30％)和SLE(0.79％)在VV中的患病率顯著高于普通人群(P<0.05)。
　　 結(jié)論：VV患者中其他AID和ALD的患病率明顯高于一般人群，提示VV可能與其伴發(fā)疾病有共同的發(fā)病基礎(chǔ)，系統(tǒng)性的免疫反應亢進可

7、能參與了VV的發(fā)病。
　　 第二部分 VV患者Teff/Treg失衡
　　 目的：研究Teff亞群和Treg在VV中的變化情況，明確Teff/Treg失衡與VV病情進展的關(guān)系。
　　 方法：用流式細胞術(shù)檢測50例VV患者和20例正常對照外周血中Teff亞群(Th1、Th2、Th17、Th22、Tc1、Tc2、Tc17、Tc22、CTL)以及Treg的百分率；用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測Teff亞群和Tre

8、g相關(guān)細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β、IL-10)在患者血清中的濃度；用免疫組化檢測CD8+細胞、IFN-γ+細胞、IL-17A+細胞、IL-22+細胞或Foxp3+細胞在患者皮膚中的浸潤情況；用磁珠分選的CD4+CD25+Treg細胞與自體CD8+T細胞或CD4+CD25-Fresp細胞共培養(yǎng)以研究Treg對自身Teff體外增殖的抑制作用。
　　 結(jié)果：VV患者外周血

9、中Tc/CTL各效應亞群、Th17和Th22亞群百分率升高，而Treg百分率降低：進展期患者血清中Teff相關(guān)的細胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17A和IL-22的濃度高于正常對照，而Treg相關(guān)的TGF-β濃度下降；進展期白斑邊緣皮膚中表達CD8、IFN-γ、IL-17A或IL-22的Teff細胞以及表達Foxp3的Treg細胞數(shù)量比正常人皮膚明顯增多：來自進展期VV患者外周血的Treg細胞對自體CD8+T細胞和CD4+CD25-

10、Tresp細胞增殖及促炎癥因子釋放的抑制作用比正常對照明顯降低。
　　 結(jié)論：VV患者中存在Teff/Treg的失衡，Treg在外周血中比例下降和功能受損不能有效抑制Teff的擴增和活化，可能參與了VV及其伴發(fā)的AID和ALD的發(fā)生發(fā)展。
　　 第三部分 Teff相關(guān)細胞因子對MC生物學功能的影響
　　 目的：探討進展期VV患者中升高的Teff亞群相關(guān)細胞因子對人MC生物學功能的影響
　　 方法：分別用來

11、自進展期VV患者PBMC刺激上清，磁珠分選的CD4+T細胞或CD8+T細胞刺激上清，加入抗IFN-γ、抗IL-17A或抗IL-22抗體的CD4+T細胞或CD8+T細胞刺激上清，以及不同濃度的細胞因子IFN-γ、IL-17A或IL-22作用于體外培養(yǎng)的人MC48小時，用CCK8法檢測不同給藥組MC的生長增殖、L-DOPA法檢測酪氨酸酶(TYR)活性以及NaOH溶解法檢測黑素合成量的變化；用熒光定量PCR檢測IFN-γ、IL-17A或IL-

12、22對MC的TYR、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP)-1和MITF的tuRNA表達的影響。
　　 結(jié)果：患者的PBMC刺激上清，CD4+T細胞或CD8+T細胞刺激上清皆能抑制MC的生物學功能；CD4+T細胞或CD8+T細胞刺激上清中加入抗IFN-γ、抗IL-17A或抗IL-22抗體后細胞功能有所恢復；不同濃度的細胞因子IFN-γ、IL-17A或IL-22對MC合成黑素的功能皆有一定的抑制作用；IFN-γ、IL-17A和IL-22皆可抑

13、制MC的TYR和MITFmRNA的表達。
　　 結(jié)論：進展期VV患者的Teff亞群可通過分泌更高濃度的細胞因子IFN-γ、IL-17A和IL-22抑制MC合成黑素的功能，這可能是導致VV患者皮膚出現(xiàn)色素脫失斑的原因。
　　 第四部分IFN-γ、IL-17、IL-22誘導MC凋亡的作用
　　 目的：了解細胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-22誘導體外培養(yǎng)的人MC發(fā)生凋亡的作用。
　　 方法：400ng/

14、ml濃度的IFN-γ、IL-17A和IL-22分別作用于體外培養(yǎng)的MC48小時，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，Hoechst33258染液觀察細胞核變化，AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測MC凋亡率。
　　 結(jié)果：IFN-γ，能誘導高比例的MC發(fā)生凋亡，凋亡細胞鏡下表現(xiàn)為細胞變扁平，樹突消失，胞核碎裂：Hoechst33258胞核染色呈濃染致密的顆粒塊狀熒光；Annexin V/PI染色顯示發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例均明