細(xì)胞自噬在黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用.pdf

1、目的：黑素細(xì)胞氧化損傷涉及多種色素相關(guān)性皮膚病的發(fā)病機(jī)制，如白癜風(fēng)、黑色素瘤等。黑素細(xì)胞由于其特殊的功能，以及所處的位置，極易受到內(nèi)外環(huán)境誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過量活性氧簇造成的氧化損傷，活性氧簇能攻擊黑素細(xì)胞，干擾黑素細(xì)胞正常的代謝、增殖及分化，造成細(xì)胞線粒體功能受損、DNA破壞、蛋白修飾改變等，最終可導(dǎo)致黑素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變或凋亡。細(xì)胞自噬是一種普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的，高度保守的依賴溶酶體的降解途徑，能降解大分子蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器及

2、外來微生物等。近來大量研究證實(shí)細(xì)胞自噬與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，且發(fā)現(xiàn)多種氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)病過程與自噬功能障礙密切相關(guān)，如心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病、帕金森病等。但目前國內(nèi)外目前對于細(xì)胞自噬與黑素細(xì)胞氧化損傷之間的關(guān)系還沒有研究透徹。因此本研究旨在通過檢測正常人黑素細(xì)胞氧化損傷時細(xì)胞自噬的變化，以及檢測細(xì)胞自噬對黑素細(xì)胞氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響，來初步探討自噬在黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激中扮演的角色。
　　方法：
　　1、從年齡

3、<10周歲的兒童包皮組織上分離正常人原代黑素細(xì)胞，將其與人黑素細(xì)胞系 PIG1進(jìn)行培養(yǎng)：人原代黑素細(xì)胞、正常人黑素細(xì)胞系PIG1分別培養(yǎng)于254培養(yǎng)基中，放入37℃、含5％CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基及漂浮細(xì)胞情況，一般隔2日或3日換液，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)70%-80%時，以0.25%的胰酶消化傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、構(gòu)建黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型：分別用1.0mM的 H2O2處理正常人原代黑素細(xì)胞和人黑素細(xì)胞系PIG1，處理

4、24小時后，用MTS法檢測細(xì)胞活性。
　　3、通過免疫印跡檢測黑素細(xì)胞氧化損傷下自噬相關(guān)蛋白P62、LC3的表達(dá)情況，并用激光共聚焦顯微鏡觀察氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成情況。
　　4、分別用自噬促進(jìn)劑及自噬抑制劑預(yù)處理黑素細(xì)胞后，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激下細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果：1、原代黑素細(xì)胞在1.0mM H2O2處理24h后，細(xì)胞活性降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、（P<0.05）。
　　2、1.0mM H2O2處理黑素細(xì)胞后，黑素細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)
　　逐漸增高，LC3I表達(dá)逐漸下降，蛋白 P62表達(dá)逐漸下降，自噬小體數(shù)量明顯增多。抑制黑素細(xì)胞自噬后，黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡水平高于對照組，線粒體膜電位下降（P<0.05）；促進(jìn)黑素細(xì)胞自噬后，黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡水平低于對照組，線粒體膜電位增高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、1.0mM