蛋白磷酸酶4在TNF-α誘導的肝臟胰島素抵抗中的作用機制研究.pdf

1、目的:蛋白磷酸酶4(Protein phosphatase4，PP4)是PP2A家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)許多重要的細胞進程，如中心體的成熟、微管的組織和生長、DNA損傷修復，并與胰島素受體底物4(Insulin receptor4，IRS4)的降解和肝糖代謝有關。本研究通過建立TNF-α誘導的胰島素抵抗的細胞和動物模型，分析細胞或肝臟組織中PP4的表達及活性的變化，探討PP4在TNF-α誘導的肝臟胰島素抵抗中的作用及其機制。
　　

2、 方法:TNF-α(10ng/ml)刺激人肝癌細胞系HepG2和C57BL/6小鼠原代肝細胞24h，建立胰島素抵抗的細胞模型;C57BL/6小鼠背部皮下埋植TNF-α(8μg/kg·day)緩釋泵處理7天，建立TNF-α誘導的胰島素抵抗動物模型。用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PP4高表達質(zhì)粒HA-PP4和轉(zhuǎn)染PP4活性抑制突變體質(zhì)粒FLAG-PP4RL的HepG2細胞克隆;應用PP4-siRNA及PP4-shRNA干擾HepG2細胞與原代

3、肝細胞中PP4的表達，獲得PP4低表達的HepG2細胞和原代肝細胞;構建PP4-shRNA腺病毒載體，通過尾靜脈注射C57BL/6小鼠，建立肝臟PP4低表達的動物模型。測定小鼠血糖、血脂、胰島素和TNF-α水平。用蒽酮法檢測細胞和肝臟組織中的糖原水平，Real-time PCR測定糖異生相關基因(G6Pase、PEPCK、PGC1-α)的表達，Western blot分析細胞或肝臟組織胰島素信號通路中JNK、P-JNK、IRS1、P-I

4、RS1、AKT、P-AKT、GSK、P-GSK和PP4的水平，用免疫沉淀結(jié)合絲/蘇氨酸磷酸酶活性分析法測定PP4的活性。免疫共沉淀結(jié)合Western blot檢測PP4與IRS1的相互作用。
　　 結(jié)果:1.我們首先以2型糖尿病小鼠-db/db小鼠（C57BKS/J背景）為胰島素抵抗模型，檢測到血糖、胰島素和TNF-α水平顯著升高，而胰島素敏感指數(shù)(ISI)降低。蒽酮法檢測結(jié)果顯示肝組織糖原含量顯著降低，Western blot

5、結(jié)果表明糖原合成和糖異生相關信號通路受損:JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平增強，而GSK、AKT的磷酸化水平下降，同時伴有IRS1表達下降及PEPCK表達增加。這些結(jié)果表明db/db小鼠的肝臟發(fā)生了胰島素抵抗。我們還觀察到db/db小鼠肝組織中PP4的表達和活性均顯著增強，提示PP4可能參與了肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。在體外試驗中，我們采用10ng/mlTNF-α處理HepG2細胞和C57BL/6小鼠原代肝細胞24h，建立

6、胰島素抵抗細胞模型。在這兩種細胞的胰島素抵抗模型中，糖原含量顯著下降，糖異生相關基因表達增加，細胞的糖原合成信號通路受損: JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平升高，而GSK和AKT的磷酸化水平下降。Western blot和磷酸酶活性分析結(jié)果顯示PP4的表達和活性均增強。在TNF-α誘導的C57BL/6小鼠胰島素抵抗動物模型中，血清胰島素水平升高，ISI降低，肝臟組織中糖原含量顯著下降，糖異生相關基因（G6Pase、PE

7、PCK、PGC1-α）的mRNA水平升高。肝臟組織的糖原合成信號通路受損:IRS1和JNK的磷酸化水平顯著增加，而GSK和AKT的磷酸化水平及IRS1表達水平顯著降低。同時肝臟組織PP4的表達和活性增強。細胞和動物實驗結(jié)果均提示PP4參與了TNF-α誘導的肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。2.為了進一步探討PP4在TNF-α誘導的肝臟胰島素抵抗中的作用及機制，我們針對PP4的表達和活性，分別建立了穩(wěn)定高表達PP4以及PP4活性被抑制的HepG2細胞

8、克隆，應用PP4-siRNA及PP4-shRNA獲得PP4低表達的HepG2細胞和原代肝細胞以及肝臟PP4低表達的C57BL/6小鼠。這些細胞和動物的分析結(jié)果表明①PP4高表達的HepG2細胞中糖原含量降低，糖原合成信號通路受損;②PP4表達降低可以使HepG2細胞、原代肝細胞以及C57BL/6小鼠中糖原含量增加，糖異生相關基因表達降低，糖原合成信號通路恢復;③抑制PP4活性，HepG2細胞的糖原合成增加，糖原合成信號通路得以恢復。此外

9、，免疫共沉淀及Westernblot的結(jié)果顯示，在HepG2細胞和原代肝細胞中PP4與IRS1存在著相互調(diào)節(jié)作用。這種相互調(diào)節(jié)可能在TNF-α誘導的肝臟胰島素抵抗中起關鍵作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.在肝胰島素抵抗的細胞和動物模型中，PP4的表達和活性均顯著增強;
　　 2.PP4是TNF-α信號通路的正調(diào)控因子，促進TNF-α誘導的胰島素抵;
　　 3.PP4通過兩種方式參與TNF-α誘導的胰島素抵抗