伊維菌素的抗體制備及ELISA法殘留分析.pdf

1、本研究旨在制備和篩選針對伊維菌素(Ivermectin，IVM)的多克窿抗體，并以此抗體為核心試劑建立檢測動(dòng)物組織中IVM殘留的ELISA快速檢測方法。 將伊維菌素(Ivermectin，IVM)制備成半抗原4"-O-(單)-琥珀酰IVM和5-O-(單)琥珀酰IVM，質(zhì)譜鑒定其分子量為976和976.3，與目標(biāo)產(chǎn)物分子量一致。將半抗原4"-O-(單)-琥珀酰IVM與載體蛋白BSA和PLL偶聯(lián)，制備了免疫抗原4"-O-(單)-琥珀

2、酰IVM-BSA和4"-O-(單)-琥珀酰IVM-PLL；將半抗原5-O-(單)琥珀酰IVM和PLL偶聯(lián)，制備了又一免疫抗原5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL。半抗原5-O-(單)琥珀酰IVM與載體蛋白OVA偶聯(lián)，制備了包被抗原5-O-(單)琥珀酰IVM-OVA。在免疫抗原5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL的制備中，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對該合成的反應(yīng)條件進(jìn)行選擇，結(jié)果為在Ph8.5，PLL35mg，4℃，8小時(shí)時(shí)收率52.6％和偶聯(lián)比為30

3、.2，為最佳結(jié)果。免疫抗原與包被抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，載體蛋白與半抗原的結(jié)合比1∶14.5～1∶30.2。 以4"-O-(單)-琥珀酰IVM-BSA、4"-O-(單)-琥珀酰IVM-PLL和5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL作為免疫抗原免疫新西蘭白兔，經(jīng)過5次免疫后，三抗血清的效價(jià)可達(dá)1：105。通過非競爭抑制試驗(yàn)對血清效價(jià)測定結(jié)果及抗體純化后的Westernblot結(jié)果，可以看出以4"-O-(單)-琥珀酰IVM-PL

4、L和5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL作為免疫抗原制備得到的抗體，在免疫原性和對IVM的特異性上，無明顯差異。因5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL較4"-O-(單)-琥珀酰IVM-PLL的合成過程大大簡化，在以后建立的ELISA檢測方法中，以抗4"-O-(單)-琥珀酰IVM-BSA抗體和抗5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL抗體為基礎(chǔ)建立ELISA競爭性抑制試驗(yàn)。通過方陣法確定包被抗原、抗體的最適工作濃度，結(jié)果表明包被抗原的包被濃度為30

5、μg/ml，兩抗體的稀釋倍數(shù)均為1：105，酶標(biāo)二抗的工作濃度為1∶1000。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化選擇ELISA檢測IVM殘留的競爭反應(yīng)條件，結(jié)果表明pH值(6.4～8.4)、離子強(qiáng)度(0.05～1.5MNaCL)和甲醇濃度(5～15％(v/v))對兩種抗體的ELISA競爭反應(yīng)均無明顯影響，兩種抗體建立的ELISA競爭反應(yīng)中均以pH值7.4、離子強(qiáng)度0.50M(NaCL)和10％甲醇為基礎(chǔ)反應(yīng)條件。 研究中同時(shí)建立的三種抗體在選擇同

6、一個(gè)包被原和不同包被原時(shí)，共四個(gè)試驗(yàn)組合，來進(jìn)行IVM的ELISA殘留分析時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并比較了四組合在殘留檢測最低限和靈敏性的不同。對四個(gè)曲線分析結(jié)果為所設(shè)計(jì)的四個(gè)試驗(yàn)在用于IVM的殘留檢測時(shí)，均能滿足IVM殘留檢測要求，其中檢測限最低的為0.83ng/g，IC50最高的為7.01ng/g。對曲線的分析結(jié)果看出，以PLL做IVM的免疫增強(qiáng)載體時(shí)優(yōu)于BSA。 研究中采用的ELISA方法檢測動(dòng)物四種組織(肌肉、肝臟、血漿和牛奶)中

7、的IVM，設(shè)計(jì)兩個(gè)不同抗體和包被原組合方案，進(jìn)行了回收率的確定。兩個(gè)試驗(yàn)中(第四章試驗(yàn)5)對動(dòng)物組織中添加IVM檢測同收率在93.9％～101.2之間，變異系數(shù)不超過5.1％，(第四章試驗(yàn)6)對動(dòng)物組織中添加IVM檢測回收率在92.6％～101.7％之間，變異系數(shù)不超過6.3％，均為比較理想的結(jié)果。 研究結(jié)果表明，以抗4"-O-(單)-琥珀酰IVM-BSA抗體和抗5-O-(單)琥珀酰IVM-PLL抗體為基礎(chǔ)建立ELISA檢測方法