豬流行性腹瀉病毒S部分基因的表達(dá)、抗體制備及間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是一種急性、感染性高的腸道病毒性疾病，對(duì)新生豬仔造成很高的死亡率，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為其致病原。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科，α冠狀病毒亞科（或?qū)伲?，基因組為單股正義RNA病毒，基因組大小約28 kb。PEDV變異較大，其臨床癥狀、病理變化以及流行特點(diǎn)都與傳染性胃腸炎和輪狀病毒病的十分相似。目前，PED在世界范圍內(nèi)廣泛流行，但還沒(méi)有很好的預(yù)防和診斷方法。為此本研究選擇PEDV S基因的保守序列進(jìn)行原

2、核表達(dá)，制備相應(yīng)抗體，并初步建立一套檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1 PEDV部分S基因的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　通過(guò)DNAstar軟件對(duì)豬流行性腹瀉病毒流行毒株S基因進(jìn)行序列比對(duì)與分析，選取位于502-641氨基酸位置處的S1蛋白保守序列，利用大腸桿菌密碼子偏嗜性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，Overlap PCR合成，獲得417 bp基因片段，連接到克隆載體pJET/1.2-blunt上，并構(gòu)建重組表

3、達(dá)質(zhì)粒pET32a-S417和pXXGST-S417。
　　2重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化
　　將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)割膠純化，獲得重組蛋白GST-S417，分子量31 kD左右，濃度0.3 mg/mL左右，純度達(dá)95％以上；通過(guò)過(guò)柱純化，獲得重組蛋白His-S417，分子量30 kD左右，濃度0.1 mg/mL左右，純度達(dá)90%以上。
　　3多克隆抗體的制備
　　以純化的GST

4、-S417重組蛋白作為免疫原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，免疫量500μg/只。以純化的His-S417重組蛋白作為包被抗原，檢測(cè)免疫血清中抗體的效價(jià)，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明血清效價(jià)達(dá)1:10000以上，而且制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別目的蛋白。該研究表明所選的S蛋白區(qū)域具有一定的抗原性。
　　4間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立
　　包被純化的GST-S417蛋白，摸索最佳間接ELISA條件，結(jié)果顯示：包被量0.32μg