間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株(K3)的腫瘤干性和轉(zhuǎn)移潛能實驗研究.pdf

1、目的：建立大鼠骨髓間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變致瘤單克隆腫瘤細胞株(K3)的裸鼠轉(zhuǎn)移模型;經(jīng)多次裸鼠體內(nèi)傳代轉(zhuǎn)移后獲得具有高轉(zhuǎn)移潛能的細胞株;探討高轉(zhuǎn)移潛能細胞株的腫瘤干性特征變化及可能機制。
　　 方法：大鼠問質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株(K3)以1×106細胞/只接種于BALB/c-nu裸鼠皮下、脾臟內(nèi)或脛骨端骨髓腔內(nèi),觀察腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤后,再重復(fù)致瘤一次后將肝和肺轉(zhuǎn)移腫瘤細胞體外原代培養(yǎng)擴增,并經(jīng)有限稀釋后,獲

2、得了單克隆化的K3來源的肝轉(zhuǎn)移細胞株(K3-F4)和肺轉(zhuǎn)移細胞株(K3-B6)。通過transwell實驗分析K3-F4,K3-B6細胞體外遷移和侵襲能力,熒光定量RT-PCR及Westernblot分析這兩種細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達情況,并通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將K3,K3-F4,K3-B6細胞標記紅色熒光蛋白后經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi),活體成像觀察裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能。通過軟瓊脂克隆形成實驗分析K3-F4,K3-B6細胞體外成球能力,Weste

3、rnblot檢測他們的干性基因表達水平,皮下致瘤實驗觀察體內(nèi)致瘤能力。通過免疫熒光、Westernblot、熒光定量RT-PCR實驗分析K3-F4,K3-B6細胞EMT相關(guān)指標的表達情況。
　　 結(jié)果：K3細胞株接種于BALB/c-nu裸鼠體內(nèi)30d左右,皮下注射組裸鼠各器官未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,脾臟內(nèi)注射組裸鼠發(fā)生了肝臟轉(zhuǎn)移,骨髓腔注射組裸鼠發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。通過單個細胞培養(yǎng)獲得單克隆的肝轉(zhuǎn)移細胞株(K3-F4)和肺轉(zhuǎn)移細胞株(K3-B6

4、)。Transwell遷移和侵襲實驗及小動物活體成像觀察到,K3-F4,K3-B6細胞與K3細胞株的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移潛能有很大差異(P＜0.05),K3-F4,K3-B6細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2,CXCR4的表達高于K3細胞。軟瓊脂克隆形成實驗及裸鼠皮下致瘤實驗結(jié)果顯示,K3-F4,K3-B6細胞的體內(nèi)外致瘤能力較K3細胞強,并且腫瘤干性相關(guān)基因ABCG2,CD133,CD166,Bmi-1的蛋白表達也高于K3細胞。免疫熒光分析顯示K3-F

5、4,K3-B6細胞內(nèi)Vimentin的表達高于K3細胞。Westenbolt結(jié)果顯示K3-F4,K3-B6細胞中Vimentin和N-cadherin蛋白高表達。EMT促進分子snail,slug,ZEB1,在K3-F4,K3-B6細胞中的mRNA水平也明顯高于K3細胞,而EMT負調(diào)控分子miR-200a表達下調(diào)。
　　 結(jié)論：通過脾臟注射和骨髓腔注射的方法成功建立了大鼠間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株(K3)的肝臟和肺部轉(zhuǎn)移模型。