miR-9對鼻咽癌增殖、腫瘤干細(xì)胞“干性”、EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　 鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤，其惡性程度較高，且具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。我國是鼻咽癌發(fā)病率最高的國家，以廣東、廣西、湖南、福建等南方地區(qū)為著。早在80年代初，姚開泰就提出了鼻咽癌發(fā)病的三擊/多步假說，認(rèn)為EB病毒(EBV)、化學(xué)致癌物和胚性擊中（即遺傳因素或自發(fā)突變）是構(gòu)成NPC的主要病因，不僅為一系列后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)，而且對鼻咽癌的防治具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。生活方式已被證實(shí)和鼻咽癌的發(fā)病有關(guān)，尤

2、其吸煙不僅是個(gè)體鼻咽癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素，也與EB病毒血清陽性的健康男性的發(fā)病相關(guān)，吸煙能誘導(dǎo)EB病毒的活動(dòng)。因此，鼻咽癌的發(fā)生是多因素、多基因、多階段、多途徑的。鼻咽癌治療方法包括放射治療、外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、免疫和生物治療，基因靶向治療也為鼻咽癌的治療提供新的前景。
　　 2011年Weinberg指出腫瘤具有自給自足的生長信號(hào)、抗生長信號(hào)的不敏感、抵抗細(xì)胞死亡、潛力無限的復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤和轉(zhuǎn)移、避免免

3、疫摧毀、促進(jìn)腫瘤的炎癥、細(xì)胞能量異常、基因組不穩(wěn)定和突變十種特征，并綜述了針對以上特征的靶向治療方法。大多數(shù)實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境中存在各種類型的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞等。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是指可以自我更新和分化成為不同表型的腫瘤細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞假說認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中有一小部分細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和生長，具有無限的自我更新和復(fù)制能力，并對放療和化療產(chǎn)生抵抗。不同腫瘤的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物不同?；贑SCs的特性，有效殺滅清除

4、CSCs被認(rèn)為是根治腫瘤的有效途徑之一。目前針對CSCs的靶向治療主要有靶向抑制其表面標(biāo)志物，調(diào)節(jié)CSCs通路，誘導(dǎo)CSCs向腫瘤細(xì)胞分化，細(xì)胞治療(如誘導(dǎo)生成γδT cells殺傷CSC)等。
　　 轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，腫瘤的轉(zhuǎn)移是影響患者生存期的首要因素，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，亦是迫切要解決的重大問題之一。腫瘤轉(zhuǎn)移最突出的特征是不同的腫瘤能在人體內(nèi)相同或不同的部位形成轉(zhuǎn)移，即腫瘤轉(zhuǎn)移的組織特異性。上皮

5、-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要階段。
　　 miRNAs是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21-25個(gè)核苷酸組成，在動(dòng)物和植物，它們是重要的調(diào)節(jié)分子，每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因，它

6、們通過與其靶基因的相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控生物體的生長發(fā)育。最近的研究表明，一些miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的過程，在腫瘤的形成中是很重要的，一些miRNAs可作為癌基因或抑癌功能，miRNA表達(dá)譜可能成為腫瘤診斷的有用的生物標(biāo)志物，而miRNAs可能是一個(gè)功能強(qiáng)大的工具，用于腫瘤的預(yù)防和治療。
　　 研究表明，miR-9在多種人體腫瘤組織中異常表達(dá)，如miR-9在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等中表達(dá)下調(diào)，但在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)

7、上調(diào)。miR-9在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、EMT、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。有研究人員的基因芯片結(jié)果顯示，miR-9在人NPC組織標(biāo)本上表達(dá)下調(diào)，但功能不詳。
　　 我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-9在人NPC細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，但在NPC組織標(biāo)本上表達(dá)卻上調(diào);同時(shí)，miR-9過表達(dá)抑制NPC細(xì)胞體內(nèi)外增殖，而miR-9過表達(dá)卻促進(jìn)NPC細(xì)胞發(fā)生EMT和遷移。以上這些似乎自相矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果促使我們?nèi)ド钊虢馕鰉iR-9在人NPC發(fā)病中

8、的作用及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一章、miR-9靶向調(diào)控CCNG1抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖
　　 1.質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后，NaAC、乙醇沉淀法純化質(zhì)粒。
　　 2.穩(wěn)定細(xì)胞株建立包裝載體PMD2G和穿梭載體PPAX2與目的質(zhì)粒lipotemin2000共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，得到的病毒上清以濃度梯度方式感染細(xì)胞，嘌呤霉素2μg/ml(GIBCO)作用約2周殺死未感染細(xì)胞，或者流式細(xì)胞儀分選出成功

9、感染的細(xì)胞。
　　 3.TRIzol—氯仿抽提法提取RNA，按照Bio-Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime qPCR)檢測miRNA和基因mRNA水平的表達(dá)。Western blot檢測基因蛋白水平表達(dá)。免疫組化檢測組織中基因表達(dá)位置和含量。
　　 4.CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線，平板克隆實(shí)驗(yàn)觀測細(xì)胞增殖情況。
　　 5.流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測。
　　

10、6.熒光素酶活性檢測:
　　 螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值驗(yàn)證3'-UTR靶向結(jié)合位點(diǎn)活性。
　　 7.皮下成瘤觀測細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤和增殖情況，肝包膜異位成瘤觀測細(xì)胞的成瘤和轉(zhuǎn)移情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR各細(xì)胞株2-ΔΔCt比較采用單因素方差分析(One-way ANONA);轉(zhuǎn)染后miR-9表達(dá)、細(xì)胞周期

11、、平板克隆的兩組間比較及免疫組化結(jié)果采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);CCK-8生長曲線及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中皮下成瘤體積比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)值大小以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)來表示。
　　 第二章、miR-9靶向調(diào)控Hes1在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞干性維持中作用及機(jī)制
　　 1.TRIzol—氯仿抽提法提取RNA，按照Bio-Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime

12、 qPCR)檢測miRNA和基因mRNA水平的表達(dá)。
　　 2.Western blot檢測基因蛋白水平表達(dá)。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光觀察基因在細(xì)胞中表達(dá)的定位和表達(dá)水平。
　　 4.免疫組化檢測組織中基因表達(dá)位置和含量。
　　 5.腫瘤球培養(yǎng)、SP細(xì)胞比例檢測觀測腫瘤細(xì)胞的“干性”。
　　 6.熒光素酶活性檢測:
　　 螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的

13、RLU值驗(yàn)證3'-UTR靶向結(jié)合位點(diǎn)活性。
　　 7.miR-9的治療作用:
　　 皮下成瘤后，miR-9 mimics通過轉(zhuǎn)染試劑注射至瘤體內(nèi)，觀察瘤體生長情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。腫瘤球計(jì)數(shù)及免疫組化結(jié)果采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 第三章、c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用
　

14、　 1.質(zhì)粒擴(kuò)增提取和純化、穩(wěn)定細(xì)胞株建立、熒光素酶活性檢測、Western blotting、免疫組化、細(xì)胞免疫熒光見第一、第二章。
　　 2.Transwell遷移試驗(yàn)、Boyden侵襲試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　 3.熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色試驗(yàn)和激光共聚焦觀察細(xì)胞骨架變化。
　　 4.掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 5.細(xì)胞粘附試驗(yàn)和倒置顯微鏡觀測細(xì)胞粘附能力。
　　 6.肝包膜下

15、移植后觀測移植位點(diǎn)的成瘤情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR2-ΔΔCt兩兩比較比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);Transwell和Boyden小室結(jié)果多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANONA)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);細(xì)胞粘附能力比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)值大小以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）來表示。

16、
　　 第四章、miR-9調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中免疫和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)
　　 1.人類基因U133 Plus2.0陣列分析基因表達(dá)譜。
　　 2.RNA提取、逆轉(zhuǎn)、實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR各細(xì)胞株2-ΔΔCt比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)值大小以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）來表示。
　　 結(jié)果：<

17、br>　　 第一章、miR-9靶向調(diào)控CCNG1抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖
　　 1.miR-9在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測了miR-9在NP-69、6-10B、5-8F、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:miR-9在鼻咽癌細(xì)胞株上表達(dá)較NP-69明顯下降(F=370.010，P=0.000)。
　　 2.構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-9細(xì)胞株將

18、三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)(LV-con或LV-miR-9，PMD2G和PPAX2)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，產(chǎn)生兩種病毒，即空白對照(LV-con)病毒和過表達(dá)miR-9(LV-miR-9)的病毒。轉(zhuǎn)染72h后，收病毒上清感染細(xì)胞CNE2、HONE1、SUNE1，48h后觀察綠色熒光，嘌呤霉素殺死未感染的細(xì)胞后，用qRT-PCR檢測miR-9表達(dá)情況，結(jié)果示各種細(xì)胞較對照細(xì)胞miR-9表達(dá)均顯著升高(t=7.355、5.451、5.794，P=0.0

19、18、0.032、0.029)。
　　 3.qRT-PCR檢測鼻咽癌細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNAs后miR-9的表達(dá)采用脂質(zhì)體法將miR-9 mimics和inhibitor及其對照mimics con和inhibitorcon轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48h后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測miR-9的表達(dá)。結(jié)果示，miR-9 mimics成功使CNE2、HONE1、SUNE1中miR-9過表達(dá)(t=7.619、11.224、

20、5.228，P=0.017、0.000、0.035)而inhibitor降低CNE2和5-8F中miR-9的表達(dá)水平(t=10.924、14.95，P=0.000、0.004)。
　　 4.miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖
　　 4.1 CCK-8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖我們采用CCK-8法檢測細(xì)胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)CNE2細(xì)胞過表達(dá)miR-9后細(xì)胞生長變慢，而抑制miR-9后細(xì)胞生長加快(P=0.00

21、0)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)示，miR-9可顯著減少CNE2、HONE1、SUNE1細(xì)胞克隆形成(t=7.721、2.744、16.545，P=0.000、0.034、0.000)。以上結(jié)果表明，miR-9過表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。
　　 4.2 miR-9影響鼻咽癌細(xì)胞的周期分布為研究miR-9抑制增殖的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測了miR-9對鼻咽癌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，miR-9過表達(dá)后，CNE2和HONE1細(xì)胞呈現(xiàn)G0-G1期阻

22、滯，而miR-9抑制后，G0-G1期的細(xì)胞較對照組顯著減少。
　　 5.miR-9過表達(dá)抑制CNE2細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力為研究miR-9對鼻咽癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖的影響，我們首先將過表達(dá)miR-9的CNE2細(xì)胞及其對照細(xì)胞接種至4只裸鼠背部皮下，細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，接種后第34天取材。結(jié)果對照組均成瘤，而miR-9過表達(dá)組均未成瘤。接著，我們將過表達(dá)miR-9的CNE2細(xì)胞及其對照細(xì)胞的皮下接種細(xì)胞數(shù)提高至1.5×106個(gè)，接種后第

23、21天取材。結(jié)果示，對照組均成瘤，而miR-9過表達(dá)組僅一只成瘤。
　　 此外，我們進(jìn)行了肝包膜下CNE2細(xì)胞異位移植成瘤，實(shí)驗(yàn)組與對照組移植細(xì)胞數(shù)均為1.2×106個(gè)，接種第23天取材，發(fā)現(xiàn)miR-9過表達(dá)組在肝包膜下均未成瘤，而對照組全部成瘤。
　　 6.miR-9過表達(dá)抑制SUNE1細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力如上所述，miR-9過表達(dá)的CNE2細(xì)胞皮下成瘤能力及肝包膜下異位移植能力均顯著下降。接下來我們研究了miR-9過

24、表達(dá)的SUNE1細(xì)胞的皮下成瘤能力。將過表達(dá)miR-9的SUNE1細(xì)胞及其對照細(xì)胞接種至5只裸鼠背部皮下，細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，接種后第19天取材。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-9過表達(dá)的SUNE1細(xì)胞成瘤后瘤體較對照組顯著減?。╰=4.279，P=0.003），且生長速度顯著減慢(F=34.112，P=0.000)。此外，miR-9過表達(dá)組組織中BrdU+和Ki67+的細(xì)胞均較對照組的少。
　　 7.CCNG1為miR-9的靶基因我們發(fā)現(xiàn)在

25、miR-9過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株中CCNG1表達(dá)下降，而抑制miR-9后，CCNG1表達(dá)升高，在皮下成瘤的瘤體組織中，miR-9過表達(dá)組的組織中CCNG1表達(dá)下降。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～9位核苷酸與CCNG1 mRNA3'端-UTR完全互補(bǔ)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和miR-9 mimics共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)

26、染可顯著增強(qiáng)熒光素酶活性(t=32.542、6.238，P=0.000、0.003)。突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)染均未明顯改變熒光素酶活性(t=0.455、0.241，P=0.673、0.821)。以上數(shù)據(jù)表明，CCNG1為miR-9的靶基因。
　　 8.miR-9靶向抑制CCNG1表達(dá)而使細(xì)胞增殖降低為探討CCNG1是否介導(dǎo)了miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的功能，我們

27、首先把HONE1細(xì)胞株中CCNG1沉默，以明確CCNG1表達(dá)下調(diào)是否亦抑制了細(xì)胞增殖;Western blot顯示，miR-9 mimics和siCCNG1均能下調(diào)CCNG1表達(dá)，而siCCNG1和miR-9 mimics均能抑制細(xì)胞增殖，二者均能使細(xì)胞周期G0-G1期細(xì)胞增多(F=14.134，P=0.002)，S期減少(F=24.175，P=0.000)。
　　 為研究CCNG1是否有拮抗miR-9的周期阻滯作用，我們在過表

28、達(dá)miR-9的HONE1細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)CCNG1（LV-miR-9+pC1-CCNG1），結(jié)果示，CCNG1表達(dá)升高，細(xì)胞增殖增快，G0-G1期的細(xì)胞減少(F=93.810，P=0.000)，S期和G2-M期細(xì)胞顯著增多（F=39.597、25.712，P=0.000、0.001）。綜上，CCNG1介導(dǎo)了miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的功能。
　　 第二章、miR-9靶向調(diào)控Hes1在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞干性維持中作用及機(jī)制

29、
　　 1.miR-9過表達(dá)顯著抑制NPC CSCs的自我更新miR-9過表達(dá)可顯著下調(diào)CNE2和SUNE1細(xì)胞中干性相關(guān)基因(如Nanog、Oct4和ABCG2)表達(dá)，而下調(diào)NPC細(xì)胞中miR-9表達(dá)則導(dǎo)致干性基因表達(dá)上調(diào);miR-9過表達(dá)可顯著降低NPC細(xì)胞中SP細(xì)胞含量，并極顯著抑制NPC細(xì)胞形成腫瘤球，且過表達(dá)組所形成腫瘤球的直徑小于對照細(xì)胞的(t=39.436、31.577，P=0.000、0.000)。以上結(jié)果表明，

30、miR-9至少抑制了NPC CSCs的自我更新。
　　 2.腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞所培養(yǎng)出的腫瘤球間miR-9和Hes1表達(dá)差異為了明確Hes1與鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的潛在關(guān)系，我們對miR-9和Hes1在鼻咽癌細(xì)胞（如CNE2和SUNE1細(xì)胞）和由其培養(yǎng)出的腫瘤球間基因表達(dá)差異進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，miR-9的表達(dá)在腫瘤球和腫瘤細(xì)胞間無明顯差異(t=0.765、0.653，P=0.487、0.533)，而腫瘤球中Hes1、Sox2、O

31、ct4、Nanog和ABCG2的表達(dá)均較腫瘤細(xì)胞的高。這預(yù)示Hes1在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞上發(fā)揮一定的功能。
　　 3.Hes1過表達(dá)顯著促進(jìn)了NPC CSCs的自我更新Hes1過表達(dá)可顯著上調(diào)CNE2和SUNE1細(xì)胞中干性相關(guān)基因(即Nanog和ABCG2)表達(dá)，而下調(diào)NPC細(xì)胞中Hes1表達(dá)則導(dǎo)致干性基因表達(dá)下調(diào);流式細(xì)胞儀分析表明，Hes1過表達(dá)可顯著增加NPC細(xì)胞(CNE2和SUNE1細(xì)胞)中SP細(xì)胞含量，而下調(diào)Hes1則顯

32、著下調(diào)NPC細(xì)胞（CNE2和SUNE1細(xì)胞）中SP細(xì)胞含量;腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)Hes1的CNE2和SUNE1細(xì)胞較對照組的成球能力顯著增強(qiáng)(t=14.902、20.412，P=0.003、0.000)，而抑制Hes1組的成球能力顯著下降(t=14.248、18.251，P=0.000、0.000)。以上數(shù)據(jù)提示，Hes1參與了NPC CSCs自我更新的調(diào)控。
　　 4.Hes1是miR-9的靶基因既然miR-9參與了NP

33、C CSCs自我更新的調(diào)控，其通過下游哪一個(gè)靶基因?qū)崿F(xiàn)？我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-9過表達(dá)降低NPC細(xì)胞（即CNE2和SUNE1細(xì)胞）中Hes1表達(dá)，而下調(diào)miR-9表達(dá)則導(dǎo)致Hes1表達(dá)上調(diào);CNE2和SUNE1細(xì)胞的皮下成瘤組織中，miR-9過表達(dá)組的Hes1表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～7位核苷酸與Hes1 mRNA3'端-UTR完全互補(bǔ)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和m

34、iR-9 mimics共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)染可顯著增強(qiáng)熒光素酶活性(t=23.089、11.573，P=0.000、0.000);突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)染均未明顯改變熒光素酶活性(t=1.075、0.218，P=0.343、0.838)。以上數(shù)據(jù)表明，Hes1為miR-9的靶基因。
　　 5.Hes

35、1介導(dǎo)了miR-9抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞自我更新的功能在明確Hes1是miR-9的靶基因基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步闡明miR-9是否通過下調(diào)Hes1表達(dá)抑制了鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新。Western blot結(jié)果顯示，miR-9和Hes1共同過表達(dá)組中Nanog和ABCG2的表達(dá)水平較miR-9組的高，SP細(xì)胞含量較miR-9組的高，且Hes1過表達(dá)后有效阻斷了miR-9抑制腫瘤球形成的能力(F=162.277，P=0.000)。綜上，miR-9

36、抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞自我更新的功能可由其靶基因Hes1介導(dǎo)。
　　 6.探討miR-9潛在的治療價(jià)值為研究miR-9對鼻咽癌的治療作用，我們進(jìn)行了miR-9的裸鼠皮下瘤內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)，首次預(yù)實(shí)驗(yàn)中，注射miR-9 Agomir組的三只裸鼠均發(fā)現(xiàn)沿進(jìn)針方向形成空洞且遷延不愈，而對照組未見空洞（數(shù)據(jù)未展示）。第二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中使用miR-9 mimics與MaxSuppressorTM In vivo RNA-LANCErⅡ共注射，結(jié)果發(fā)

37、現(xiàn)miR-9可抑制瘤體生長，且部分瘤體中心出現(xiàn)空洞。兩組分別提取組織RNA和蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中miR-9成功過表達(dá);且其靶基因CCNG1和Hes1均被抑制。此部分結(jié)果正在進(jìn)行第三次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 第三章、c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用
　　 1.c-Myc在鼻咽癌細(xì)胞中上調(diào)miR-9表達(dá)c-Myc過表達(dá)上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞株中miR-9表達(dá)，而下調(diào)c-Myc則抑制

38、miR-9表達(dá)。可見，c-Myc正向調(diào)控了鼻咽癌細(xì)胞中miR-9的表達(dá)。
　　 2.c-Myc靶向上調(diào)miR-9表達(dá)引起EMT相關(guān)基因表達(dá)變化為明確c-Myc對EMT相關(guān)基因是否有影響，我們首先行qRT-PCR檢測EMT相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，c-Myc過表達(dá)顯著下調(diào)HONE1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)(t=-44.880，P=0.000)，而通過RNAi抑制c-Myc表達(dá)則升高E-cadherin表達(dá)(t=3.149，

39、P=0.035);此外，c-Myc無論過表達(dá)還是通過RNAi抑制c-Myc表達(dá)均在mRNA水平對N-cadherin和Vimentin表達(dá)無顯著影響(P＞0.05)。Westernblot檢測結(jié)果表明，c-Myc過表達(dá)顯著下調(diào)HONE1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，上調(diào)Vimentin表達(dá)，而抑制c-Myc表達(dá)則上調(diào)E-cadherin表達(dá)，并下降Vimentin表達(dá)。此外，miR-9 inhibitor能阻斷c-Myc對E-cadh

40、erin和Vimentin的影響，并在CNE2細(xì)胞中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 3.c-Myc通過上調(diào)miR-9表達(dá)促進(jìn)了NPC細(xì)胞遷移和侵襲如上所述，鼻咽癌細(xì)胞中miR-9介導(dǎo)了c-Myc對E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響，接下來我們研究了c-Myc對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及miR-9在其中所起的作用。Transwell結(jié)果顯示，c-Myc促進(jìn)細(xì)胞遷移(t=12.231，P=0.000)，Boyden小室結(jié)果顯

41、示c-Myc可促進(jìn)細(xì)胞侵襲(t=10.000，P=0.000)，而miR-9 inhibitor可阻斷c-Myc促遷移和侵襲的作用(F=147.016、59.900，P=0.001、0.001)。
　　 4.miR-9對鼻咽癌細(xì)胞中EMT相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用在培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-9的細(xì)胞株過程中，發(fā)現(xiàn)CNE2和HONE1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，部分細(xì)胞變得細(xì)長且觸角增多，細(xì)胞失去原有的鋪路石樣或規(guī)整的形態(tài)，這提示miR-9過表達(dá)

42、可能誘導(dǎo)了EMT。隨后，在基因?qū)用孢M(jìn)一步明確miR-9是否確實(shí)誘發(fā)了EMT。結(jié)果表明，miR-9過表達(dá)導(dǎo)致SUNE1、CNE2、HONE1、HNE1細(xì)胞中上皮相關(guān)基因E-cadherin和α-catenin表達(dá)下降，而間充質(zhì)相關(guān)基因N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高;下調(diào)miR-9表達(dá)則引起CNE2和HONE1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)下降。以上數(shù)據(jù)提示，miR-9過表達(dá)

43、在鼻咽癌細(xì)胞上誘導(dǎo)了EMT。
　　 5.miR-9促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲我們進(jìn)一步采用Transwell和Boyden小室明確miR-9過表達(dá)對CNE2和HONE1細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-9的CNE2和HONE1細(xì)胞的遷移和侵襲能力較對照組的顯著增強(qiáng)(t=6.533、10.983;13.131、12.351，P=0.000、0.000;0.000、0.000)。劃痕實(shí)驗(yàn)亦顯示，miR-9過表達(dá)可促

44、進(jìn)CNE2和HONE1細(xì)胞遷移。綜上，miR-9可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲。
　　 6.miR-9過表達(dá)降低鼻咽癌細(xì)胞的粘附能力為研究miR-9對腫瘤細(xì)胞的粘附能力的影響，我們用0.05nM EDTA處理過表達(dá)miR-9的CNE2和HONE1細(xì)胞及其對照細(xì)胞后，miR-9過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞較對照細(xì)胞粘附能力下降(F=846.528、751.057，P=0.000、0.000)，提示過表達(dá)miR-9的鼻咽癌細(xì)胞粘附降低。
　

45、　 7.miR-9對細(xì)胞骨架的影響我們用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法檢測了miR-9過表達(dá)對CNE2和HONE1細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響，并用掃描電鏡觀測了細(xì)胞的微觀形態(tài)。結(jié)果顯示，miR-9過表達(dá)的細(xì)胞表面纖維增粗增多，偽足增多。Western blot檢測Rho酶和Rac的表達(dá)較對照的增多。提示miR-9與細(xì)胞形態(tài)改變和偽足形成等轉(zhuǎn)移起始步驟相關(guān)。
　　 8.Klf4為miR-9的靶基因miR-9過表達(dá)降低NPC細(xì)胞（即CNE2和SUNE1細(xì)

46、胞）中Klf4表達(dá)，而下調(diào)miR-9表達(dá)則導(dǎo)致Klf4表達(dá)上調(diào);CNE2和SUNE1細(xì)胞的皮下成瘤組織中，miR-9過表達(dá)組的Klf4表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～7位核苷酸與Klf4 mRNA3'端-UTR完全互補(bǔ)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和miR-9 mimics共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)染可顯著增強(qiáng)熒光素酶

47、活性(t=4.380、13.777，P=0.012、0.000);突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉(zhuǎn)染均未明顯改變熒光素酶活性(t=0.921、0.302，P=0.409、0.777)。以上數(shù)據(jù)表明，Klf4為miR-9的靶基因。
　　 9.miR-9靶向抑制Klf4進(jìn)而增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力我們的前期研究表明，Klf4在鼻咽癌細(xì)胞中具有抑制EMT、遷移和侵襲的功能，

48、為研究Klf4是否具有拮抗miR-9促進(jìn)遷移和侵襲的作用，我們在HONE1細(xì)胞過表達(dá)miR-9的基礎(chǔ)上過表達(dá)Klf4，結(jié)果過表達(dá)Klf4組（LV-miR-9+LV-Klf4）的Klf4表達(dá)升高，同時(shí)遷移和侵襲能力較LV-miR-9組顯著增強(qiáng)(F=137.015、12.438，P=0.000、0.001)。以上提示，Klf4拮抗了miR-9促遷移和侵襲的作用，即miR-9通過靶向抑制Klf4促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。
　　 10.c-M

49、yc過表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移為明確c-Myc對鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，我們把過表達(dá)c-Myc的CNE2細(xì)胞及對照細(xì)胞（細(xì)胞劑量:1×106/只）分別接種于裸鼠肝包膜下，每組7只裸鼠，結(jié)果示接種處全部成瘤，而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過表達(dá)組有5/7只，而對照2/7只。
　　 第四章、miR-9調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中免疫和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)
　　 1.miR-9引起鼻咽癌細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因表達(dá)變化微陣列分析顯示，miR-9過表達(dá)的

50、CNE2細(xì)胞中多種IFN調(diào)節(jié)的基因如IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、PSB9_HUMAN、IFIT2、TRAIL、IFIT1、PSB8_HUMAN、IRF1和B2M的表達(dá)都發(fā)生了變化。qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果(P＜0.05或0.01)。
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)miR-9對IFN調(diào)節(jié)因子的作用，我們又進(jìn)行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-9

51、 mimics組中IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表達(dá)升高，而ISG20和AIM2表達(dá)下降。相反，miR-9 inhibitor組中IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表達(dá)下降，而ISG20和AIM2表達(dá)則升高(P＜0.05或0.01)。
　　 2.m

52、iR-9引起鼻咽癌細(xì)胞中主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ型(MHCⅠ)分子表達(dá)變化微陣列分析顯示，miR-9過表達(dá)的CNE2細(xì)胞中多種主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ型(MHCⅠ)分子如HLA-B、HLA-H、HLA-C、HLA-F、Q8WW48_HUMAN、NP_001004349.1、Q6ZUW0_HUMAN、019682_HUMAN和TAP1表達(dá)升高。qRT-PCR證實(shí)了HLA-B、HLA-F和TAP1表達(dá)的變化(P＜0.05或0.01)。
　

53、　 為了進(jìn)一步證實(shí)miR-9對MHCⅠ分子的作用，我們又進(jìn)行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HLA-B、HLA-F和TAP1在miR-9 mimics組中的表達(dá)升高，而在miR-9 inhibitor組中表達(dá)下降(P＜0.05或0.01)。
　　 3.miR-9引起鼻咽癌細(xì)胞白介素(IL)相關(guān)基因表達(dá)變化微陣列分析顯示，miR-9過表達(dá)的CNE2細(xì)胞中多種IL相關(guān)基因IL20RB、G

54、ALT、IL7、IL1B、IL11、IL1F8、IL1A、IL6和IL7R等表達(dá)發(fā)生變化，結(jié)果用qRT-PCR證實(shí)(P＜0.05或0.01)。
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)miR-9對IL相關(guān)基因的作用，我們又進(jìn)行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-9 mimics可以顯著上調(diào)一些IL相關(guān)基因(IL20RB、GALT、IL7)(P＜0.05或0.01)，而下調(diào)另一些IL相關(guān)基因(IL1B、

55、IL11、IL1F8、IL1A、IL6、IL7R)(P＜0.05或0.01)。相反，miR-9 inhibitor下調(diào)IL20RB、GALT和IL7(P＜0.05或0.01)，而上調(diào)IL1B、IL11、IL1F8、IL1A、IL6和IL7R(P＜0.05或0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-9靶向下調(diào)CCNG1抑制NPC細(xì)胞增殖;
　　 2.miR-9的靶基因Hesl介導(dǎo)了miR-9抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞

56、自我更新的功能;
　　 3.c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移;
　　 4.miR-9可調(diào)節(jié)NPC細(xì)胞中免疫和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，提示miR-9可能在炎癥和腫瘤間起橋梁作用;
　　 5.miR-9靶向調(diào)控CCNG1表達(dá)抑制了NPC細(xì)胞增殖，而miR-9靶向下調(diào)Klf4表達(dá)則促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞EMT、侵襲和遷移，這些預(yù)示miR-9可通過靶向調(diào)控不同的靶基因在腫瘤細(xì)胞的增殖以及EM