通過對腫瘤細(xì)胞致瘤潛能及上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究探討腫瘤干細(xì)胞假說的本質(zhì).pdf

1、背景:
　　克隆演變學(xué)說是最早用于解釋實體腫瘤起始和進(jìn)展生物學(xué)且被大部分學(xué)者接受的學(xué)說，它主要以遺傳變異的多樣性為理論依據(jù)，認(rèn)為所有的腫瘤細(xì)胞都具有生成新的腫瘤的潛能。隨著對腫瘤研究的不斷深入，科學(xué)家提出了腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)學(xué)說，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中極小部分具有自我更新、無限增殖及分化潛能的細(xì)胞，腫瘤之所以具有無限增殖能力，其根本在于腫瘤細(xì)胞中存在占極少數(shù)量的腫瘤干細(xì)胞。目前已從人白血病、

2、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌，黑色素瘤及胰腺癌等14種常見腫瘤中分離、鑒定出CSCs。盡管目前大多數(shù)研究結(jié)果支持腫瘤起源于某類具有“干性”特征的腫瘤細(xì)胞，然而學(xué)術(shù)界對腫瘤干細(xì)胞學(xué)說還存在很大的爭議。Shipitsin等通過分析基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)盡管乳腺癌干細(xì)胞和普通乳腺癌細(xì)胞分別是更原始和更分化的細(xì)胞群體，且它們的基因表達(dá)差異可能存在預(yù)后相關(guān)性，但是這些細(xì)胞之間的遺傳學(xué)差異支持克隆進(jìn)化學(xué)說參與了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。而Kelly等通過

3、將小鼠來源的淋巴瘤和白血病細(xì)胞移植致組織兼容的小鼠中得出所有腫瘤細(xì)胞均具有高致瘤的結(jié)果，認(rèn)為腫瘤的生長在于腫瘤細(xì)胞與其周圍微環(huán)境的適應(yīng)能力而不在于細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特征。這些爭議牽涉到傳統(tǒng)的克隆演變學(xué)說，直接沖擊了腫瘤干細(xì)胞假說的基礎(chǔ)—致瘤性。這一系列的爭議給腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究及對這一學(xué)說的應(yīng)用前景提出新的挑戰(zhàn)，然而，這些爭議著實推動了腫瘤研究的進(jìn)展。另一方面，Morel等發(fā)現(xiàn)通過EMT過程能將人永生化的人正常乳腺上皮細(xì)胞(HMLE

4、s)誘導(dǎo)成乳腺癌干細(xì)胞。這些研究結(jié)果為EMT在腫瘤細(xì)胞的播散及持續(xù)生長中的作用提供了充分的證據(jù)，更重要的是，它們建立了EMT與腫瘤干細(xì)胞起源之間的聯(lián)系。總之，腫瘤干細(xì)胞研究至今，仍存在不少爭議;爭議的關(guān)鍵在于其是否具有特有的致瘤性，而分化的腫瘤細(xì)胞卻不再具有成瘤能力。其實，解決這一爭議的方法在于證實單個腫瘤細(xì)胞能否最終發(fā)展成腫瘤。然而，因為技術(shù)上的原因，目前仍很難準(zhǔn)確的將單個腫瘤細(xì)胞接種于體內(nèi)模型進(jìn)行研究。另一方面，如果這一學(xué)說是錯誤的

5、，那么之前的研究為什么會得出支持腫瘤干細(xì)胞存在的證據(jù)？科學(xué)家是否忽視了產(chǎn)生這些證據(jù)背后的本質(zhì)呢？此外，為什么會導(dǎo)致EMT具有產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞的能力？尋找這些問題的答案可能需要對腫瘤干細(xì)胞的致瘤性及EMT在介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的本質(zhì)進(jìn)行探討。
　　目的:
　　1)通過單細(xì)胞克隆擴增-成瘤法探討不同乳腺癌細(xì)胞株中致瘤性細(xì)胞所占的比例。
　　2)探討EMT與懸浮培養(yǎng)富集乳腺癌干細(xì)胞的關(guān)系。
　　3)探討EMT在

6、腫瘤干細(xì)胞特殊生物學(xué)行為中的作用。
　　4)分析導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞具有高致瘤性的潛在的機制。
　　5)乳腺癌臨床樣本中分析腫瘤干細(xì)胞表型與間充質(zhì)表型的一致性。
　　材料與方法:
　　1)CD44+/CD24-/low細(xì)胞的流式檢測及分選:將需檢測的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為每管1×106/100μl。設(shè)實驗組和同型對照組。實驗組加入CD44-FITC和CD24-PE標(biāo)記的單克隆抗體，對照組加入相應(yīng)的

7、同型對照抗體，4℃避光溫育，30min后加5mlPBS漂洗去除未結(jié)合的抗體，1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測或者分選。
　　2)單細(xì)胞克隆擴增-成瘤法:將達(dá)到80％融合狀態(tài)的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞狀態(tài)，按有限稀釋法，將細(xì)胞稀釋成10cells/ml，混勻后將細(xì)胞懸液接種于96孔板，200μl/孔，之后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察僅含1個細(xì)胞的孔并標(biāo)記，接種完后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單個細(xì)胞長成適當(dāng)大小的細(xì)胞集落后，按上述消化方法將

8、孔里的細(xì)胞集落消化并將細(xì)胞懸液相應(yīng)地接種于24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至適當(dāng)融合狀態(tài)后，按上述方法將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板培養(yǎng);相似地，細(xì)胞最后擴大培養(yǎng)于10cm×10cm培養(yǎng)皿或者T75培養(yǎng)瓶中。收集由單個細(xì)胞擴增出來的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，用5mlPBS洗滌兩次以去除殘留血清，再將細(xì)胞重懸于含1∶1matrigel的無血清的培養(yǎng)基中，最后細(xì)胞以1×107cells/200μl的體積皮下接種于4周齡雌性免疫缺陷BALB/c裸鼠體內(nèi);對

9、于雌激素受體陽性的細(xì)胞（包括T47D，MCF-7和BT474），受體小鼠同時在大腿肌注0.05mg17-β雌二醇，每周注射一次。每周兩次觸摸觀察腫瘤生長情況。
　　3)3D培養(yǎng)技術(shù)檢測單個腫瘤細(xì)胞的體外成瘤能力:水泥膠包埋96孔板的每一小孔，利用有限稀釋法將細(xì)胞制成10cells/ml，與含膠的培養(yǎng)液等比例混勻，100μl/孔接種于水凝膠包埋的孔里，顯微鏡下觀察只含單個細(xì)胞的孔并標(biāo)記;在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。

10、　　4)乳腺癌微球體的培養(yǎng):將需要進(jìn)行懸浮球培養(yǎng)的細(xì)胞重懸于不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、0.4％BSA和2％B27，以50，000cells/ml接種于六孔板（3ml/孔），在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，每隔一天加1ml新鮮培養(yǎng)基。
　　5)EMT誘導(dǎo)因子共培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞:流式細(xì)胞術(shù)分選出非腫瘤干細(xì)胞亞群重懸于分別添加有50ng/mlIL-6、20ng/mlEGF和

11、20ng/mlb-FGF、或者10ng/mlTGF-β1的相應(yīng)培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　6)MTT細(xì)胞增殖檢測及阿霉素藥物敏感性檢測:
　　細(xì)胞增殖檢測:消化收集細(xì)胞，重懸于相應(yīng)的培養(yǎng)基并計數(shù)，用有限稀釋法將細(xì)胞懸液稀釋成5×103cells/ml，吹打均勻后接種于96孔板，200μl/孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在相應(yīng)的96孔板上設(shè)調(diào)零孔，即加200μl/孔不含細(xì)胞的相應(yīng)培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)

12、12h、36h、60h、84h、108h及132h后每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
　　阿霉素藥物敏感性檢測:消化收集細(xì)胞，重懸于相應(yīng)的培養(yǎng)基并計數(shù)，用有限稀釋法將細(xì)胞懸液稀釋成5×104cells/ml，吹打均勻后接種于96孔板，

13、200μl/孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在相應(yīng)的96孔板上設(shè)調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）及對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁后，檢測孔每孔加10μl阿霉素工作液至終濃度為10μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在加藥后4h、24h、48h、72h、96h及120h后每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，同上述方法檢測吸光值。
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14、)細(xì)胞照射:采用Varian2100C直線加速器6MVX線為放射源，源皮距照射，劑量率400cGy/min，SSD=100cm，PDD=80％，照射野100mm×100mm，按0，2，4，6，8Gy的劑量分別給予照射。
　　8)克隆形成實驗及放射生物學(xué)參數(shù)及劑量存活曲線的擬合:將照射后的細(xì)胞置于37℃，5％CO2的孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)15-25天。終止培養(yǎng)后常規(guī)以PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除培養(yǎng)液中的蛋白成分，每孔加入1.5

15、ml100％甲醇，室溫固定15分鐘;PBS清洗兩次，每孔加入1ml1％的結(jié)晶紫染色后，室溫作用20分鐘;流水緩慢洗去多余染液，晾干，在顯微鏡下計算細(xì)胞＞50個的細(xì)胞克隆數(shù)，計算克隆形成率（克隆形成率=生成的克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％）和存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF=受照射細(xì)胞的克隆形成率/對照組細(xì)胞克隆形成率×100％）。最后，對所得的存活分?jǐn)?shù)的平均數(shù)進(jìn)行分析，運用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行單

16、擊多靶模型曲線擬合，并根據(jù)單擊多靶模型求出D0、Dq及N，其中l(wèi)ogN=Dq/D0。
　　9)細(xì)胞遷移能力檢測:收集細(xì)胞，用5mlPBS洗滌3次，充分去除殘留的血清，離心后將細(xì)胞重懸于含0.1％BSA的培養(yǎng)基（不含血清及細(xì)胞因子）中并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105cells/ml，吹打混勻后吸200μl細(xì)胞懸液接種于transwell上室，并在下室加入500μl完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后取出小

17、室置于24孔板，加適量的PBS泡洗5次，然后用0.4％多聚甲醛固定20分鐘，再用PBS泡洗2次，其后加適量的1％的結(jié)晶紫染色20分鐘，最后用PBS洗滌去除未染的結(jié)晶紫并用棉簽輕輕擦去上層未穿透的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，選擇隨機的5個視野計算小室底面的細(xì)胞。
　　10)制備慢病毒載體穩(wěn)定過表達(dá)miR-200c:以人基因組DNA為模板PCR擴增目的基因;表達(dá)載體酶切后回收線性化的載體片段;目的基因片段與線性化的載體片段經(jīng)同源重組

18、后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞;用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序;測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提;采用脂質(zhì)體法將慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒按比例共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，收集上清液，離心過濾后，得到慢病毒懸液。病毒滴度采用qPCR實驗進(jìn)行測定。將慢病毒和空病毒載體感染乳腺癌細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀分選出GFP(+)細(xì)胞進(jìn)行擴大培養(yǎng)。Real time qPCR檢測miR-200c表達(dá)水平。
　　11)Real time RT-PCR檢測基因的表

19、達(dá)水平:收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，基于ABI Prism 7500系列檢測系統(tǒng)，使用ToYoBo公司的SYBR Green試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR。
　　12)Western blotting檢測細(xì)胞中E-cadherin，Vimentin，CD44及CD24蛋白的表達(dá)。
　　13)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞中E-cadherin，Vimentin，CD44及CD24蛋白的表達(dá)。
　　14)免疫組化檢測

20、組織樣本中E-cadherin，Vimentin，F(xiàn)ibronectin，CD44及CD24分子的表達(dá)。
　　15)統(tǒng)計方法:實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件，以兩個或多個獨立樣本率比較的x2檢驗、單向方差分析（One-Way ANOVA）及Bonferroni多重比較方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1)致瘤性細(xì)胞普遍地存在于乳腺癌細(xì)胞株中不管是CSCs群體還是non-CSCs群體，

21、均呈現(xiàn)出高比例的克隆性細(xì)胞，形成的細(xì)胞克隆可以經(jīng)不斷擴大培養(yǎng)獲得大量的腫瘤細(xì)胞。當(dāng)達(dá)到1×107數(shù)量級時，將細(xì)胞重懸于含1∶1Matrigel的無血清培養(yǎng)基并接種于免疫缺陷的BALB/c裸鼠體內(nèi)。經(jīng)這種克隆擴增法獲得的細(xì)胞，不管它們來源于CSCs群體還是non-CSCs群體，均能在裸鼠體內(nèi)形成肉眼可見的腫瘤。而對于永生化的正常人乳腺上皮細(xì)胞僅含少量的克隆性細(xì)胞，而且這些細(xì)胞擴增出來的細(xì)胞群體不能在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)形成任何腫瘤。

22、　　2)懸浮培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞與細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)分選出來的非乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)后同樣能富集具有干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞群體;懸浮培養(yǎng)獲得的細(xì)胞具有EMT相關(guān)的基因表達(dá)模式;在高粘附培養(yǎng)板或者添加血清后細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)間充質(zhì)樣外觀;細(xì)胞免疫熒光及Western blot檢測顯示上皮標(biāo)記E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)記Vimentin的表達(dá)上調(diào)。
　　3)“腫瘤干細(xì)胞”是一群具有間充質(zhì)表型的細(xì)胞亞群分選出來的

23、非腫瘤干細(xì)胞在含有不同的EMT誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣向梭形或者星形樣轉(zhuǎn)變，這種現(xiàn)象在luminal型乳腺癌細(xì)胞中尤為明顯。誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，在luminal型細(xì)胞中顯著富集了CD44+細(xì)胞（在MCF7細(xì)胞中還顯著富集了CD44+/CD24-/low細(xì)胞），在Basal型細(xì)胞株中顯著富集了CD24-細(xì)胞，在CD44+的MCF-10A細(xì)胞中同樣顯著富集了CD24-細(xì)胞，這些細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生CD44+或者CD24-

24、細(xì)胞的結(jié)果與懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生具有這些表型的細(xì)胞的結(jié)果一致。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD44+或者CD24-細(xì)胞呈現(xiàn)出與EMT相關(guān)的基因表達(dá)模式及蛋白表達(dá)模式。
　　4)EMT并不賦予腫瘤細(xì)胞致瘤性而只是賦予腫瘤細(xì)胞其它惡性特征利用克隆擴增-成瘤法檢測了經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)后產(chǎn)生的CD44+或者CD24-細(xì)胞的致瘤潛能。發(fā)現(xiàn)經(jīng)EMT誘導(dǎo)后產(chǎn)生的這些細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出更高的克隆及成瘤能力。進(jìn)一步檢測這些細(xì)胞的其它生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL6和

25、EGF+bFGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD44+或CD24-細(xì)胞均具有顯著增高的細(xì)胞增殖能力、阿霉素抵抗、輻射抵抗及侵襲能力。
　　5)細(xì)胞增殖能力的差異可能是導(dǎo)致CSCs的發(fā)現(xiàn)的主要原因當(dāng)用含生長因子（40ng/mlEGF和40ng/mlbFGF）的基質(zhì)膠重懸non-CSCs后接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)時，non-CSCs能在相同的時間內(nèi)形成更多的腫瘤，形成的腫瘤數(shù)甚至多于CSCs在相同時間里所形成的腫瘤數(shù)。
　　6)腫瘤細(xì)胞致瘤

26、性并不依賴于間充質(zhì)特性間充質(zhì)型乳腺癌細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)miR-200c后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的MET樣改變，即從梭形的間充質(zhì)形態(tài)向鵝卵石樣上皮形態(tài)轉(zhuǎn)化。定量RT-PCR結(jié)果顯示基因呈現(xiàn)MET相關(guān)表達(dá)模式，即上皮表型相關(guān)基因E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而間充質(zhì)表型相關(guān)的基因(Vimentin、N-cadherin和Fibronectin)表達(dá)下調(diào);干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記CD44基因表達(dá)也明顯下調(diào)。流式檢測顯示穩(wěn)定表達(dá)miR-200c組細(xì)胞具有干細(xì)胞

27、標(biāo)記的細(xì)胞比例顯著減少，而非干細(xì)胞比例顯著升高。Western blot同樣證實了上皮標(biāo)記的上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)的抑制，同時伴隨明顯的CD44表達(dá)抑制。發(fā)生MET后明顯減慢了細(xì)胞的生長速度，增加了細(xì)胞對阿霉素的藥物敏感性及對輻射的敏感性，同時細(xì)胞的侵襲能力明顯受抑制。然而MET后并沒有影響克隆性及致瘤性細(xì)胞的比例。
　　7)乳腺癌臨床樣本中干細(xì)胞表型與間充質(zhì)表型高度一致腫瘤干細(xì)胞陽性的樣本中上皮型標(biāo)記E-cadherin表達(dá)的陽

28、性率為34.4％(11/32)，而在非腫瘤干細(xì)胞樣本組中E-cadherin表達(dá)的陽性率為75.0％(39/52)，兩組樣本中E-cadherin表達(dá)的陽性率有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(x2=13.570，P=0.000);另一方面，間充質(zhì)標(biāo)記Vimentin表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞組的陽性率為71.9％(23/32);而其在非腫瘤干細(xì)胞組的表達(dá)陽性率僅為21.2％(11/52)，兩組中Vimentin的表達(dá)的陽性率同樣有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（x2=21.1

29、53，P=0.000）。我們還進(jìn)一步研究了典型的間充質(zhì)表型E-cadherin-/Vimentin+(甚至E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+)在兩組樣本中的比例，發(fā)現(xiàn)這些表型在兩組樣本中的比例存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（E-cadherin-/Vimentin+∶x2=17.376,P=0.000;E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+∶x2=14.114,P=0.000)。因此

30、，在臨床腫瘤樣本中證實表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記的樣本同時表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記，從而支持了我們關(guān)于腫瘤干細(xì)胞是一群具有間充質(zhì)樣特性的細(xì)胞群體的結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1.致瘤性細(xì)胞普遍地存在于乳腺癌細(xì)胞中;
　　2.懸浮培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞與細(xì)胞經(jīng)歷EMT有關(guān);
　　3.腫瘤干細(xì)胞是一群具有間充質(zhì)表型的細(xì)胞亞群;EMT并不賦予腫瘤細(xì)胞致瘤性而只是賦予腫瘤細(xì)胞其它惡性特征，即腫瘤細(xì)胞的致瘤性并不依賴于間充質(zhì)特性;細(xì)胞增殖能力的差