腎衰養(yǎng)真膠囊對腎衰貧血大鼠及促紅細胞生成素基因表達的影響.pdf

1、慢性腎衰竭(chronicrenalfailure，CRF)是多種慢性腎臟疾病的最終結果，多并發(fā)腎性貧血、營養(yǎng)不良、骨質疏松等癥。貧血被認為是CRF的一個標志。當CRF患者腎小球濾過率(GFR)低于30ml/min時，必然出現貧血，貧血是CRF最常見癥狀之一。CRF并發(fā)貧血使患者生存率降低，增加心血管事件等重要臟器嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，嚴重影響了患者的生活質量。最近有研究表明對CRF貧血早期進行干預性治療，可減輕左心室肥厚，改善貧血對重要臟

2、器的損害，有可能改善腎功能，提高患者生活質量，因此糾正早期腎性貧血具有十分重要意義。本實驗分兩個部分研究了腎衰養(yǎng)真膠囊對腎性貧血的治療作用。第一部分檢測治療前后大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、轉鐵蛋白(TF)、血紅蛋白(Hb)、促紅細胞生成素(EPO)的水平，測定紅細胞脆性、大鼠紅細胞內谷胱甘肽(GSH)含量，比較腎性貧血大鼠的腎臟病理形態(tài)，研究腎衰養(yǎng)真膠囊改善腎性貧血大鼠貧血狀態(tài)的機理。第二部分應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT

3、-PCR)檢測大鼠髓質EPO基因的表達水平，觀察腎衰養(yǎng)真膠囊對EPO基因表達的影響。第一章腎衰養(yǎng)真膠囊對腎衰貧血的改善作用 目的：探討中藥腎衰養(yǎng)真膠囊改善腎衰貧血大鼠的機理。觀察大鼠BUN、SCr、血清鐵、Hb、TF、EPO水平的變化，測定紅細胞脆性、大鼠紅細胞內GSH含量，比較腎性貧血大鼠的腎臟病理形態(tài)。 方法：1.購入80只SD雄性大鼠，三天后，預留10只為正常組，70只參照文獻采用二步法5/6腎切除制作慢性腎衰貧血

4、模型。腹腔注射10％水合氯醛麻醉，皮膚消毒后切開大鼠右腹壁，暴露右腎，切開上、下兩極的包膜，呈放射狀切除右腎上、下兩極，切除約70％，迅速用明膠海綿輕壓在殘留腎的創(chuàng)面后，依次縫合關腹。10天后經左腹壁暴露左腎，血管鉗夾住血管，結扎，摘除左腎。六周后斷尾取血，經全自動生化分析儀檢測血清BUN、Scr和TF，堿化血紅蛋白法測血紅蛋白，留取血清待測血清鐵、EPO含量。符合模型條件的大鼠隨機分為五組，即空白對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、

5、益血生組。正常組不施加任何影響，空白對照組予蒸餾水灌胃，益血生組予益血生膠囊3g/kg灌胃，高、中、低劑量組大鼠分別給予腎衰養(yǎng)真膠囊16g/kg、8g/kg、4g/kg(生藥含量)灌胃一個月。所有大鼠在整個實驗期間均喂標準飲食，自由進水。治療結束后，腹主動脈采血，預留2ml以肝素抗凝，其余分離血清，測定BUN、血Scr、TF、血清鐵、EPO含量。 2.血生化檢測：采用OlimpasAU600自動生化分析儀測BUN、SCr、TF。

6、 3.一般指標檢測：血紅蛋白應用堿化血紅蛋白比色法檢測，用紫外分光光度計檢測吸光度換算結果；全血GSH檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，用紫外分光光度計檢測吸光度換算結果；血清鐵測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，用紫外分光光度計檢測吸光度換算結果；血清EPO含量檢測采用酶鏈免疫吸附試驗(ELISA)法(購自美國TPI公司)。 4.紅細胞脆性試驗：參照文獻取抗凝血滴入不同濃度的氯化鈉溶液(2.4g/L，2.8g

7、/L，3.2g/L，3.6g/L，4.0g/L，4.4g/L，4.8g/L，5.2g/L，5.6g/L，6.0g/L)，每管一滴，搖勻后靜置4℃冰箱兩個小時，觀察結果。 5.大鼠腎組織病理學觀察：實驗末解剖大鼠，每組選兩只留取殘余腎組織放置10％福爾馬林液中固定，行過碘酸雪夫(PAS)染色。 結果：1.給藥前后血紅蛋白變化：給藥前模型各組之間血紅蛋白水平無顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。

8、給藥后腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量組血紅蛋白值高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，高、中劑量組間無明顯差異(P＞0.05)。低劑量組、益血生組高于對照組(P＜0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量改善貧血作用優(yōu)于益血生。 2.給藥前后血清鐵、轉鐵蛋白變化：給藥前模型各組之間血清鐵、轉鐵蛋白水平無顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。給藥后治療各組血清鐵、轉鐵蛋白值高于對照組(P＜0.05)，高、中劑量組

9、和益血生組間無明顯差異(P＞0.05)，但明顯高于低劑量組(P＜0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量和益血生有促進鐵吸收、利用的作用。 3.各組間紅細胞脆性比較：正常組脆性小于低劑量組和對照組(P＜0.05)，治療組間無顯著性差異(P＞0.05)，低劑量組脆性小于對照組。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量、益血生有降低紅細胞脆性的作用。 4.各組間血液中GSH含量比較：各組GSH含量明顯高于對照組(P＜0.01)。高、中劑量組

10、血液中GSH含量高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，正常組、高、中劑量組間無顯著性差異(P＞0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量提高血液中GSH含量的作用優(yōu)于益血生。 5.給藥前后血清EPO水平比較：給藥前模型各組之間EPO水平無顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。給藥后，各組血清EPO水平仍顯著低于正常組(P＜0.01)，但高、中劑量組EPO水平明顯升高，與給藥前有顯著性差異(P＜0.01)

11、，低劑量組略升高(P＜0.05)，益血生組無統(tǒng)計學差異。高、中劑量組EPO水平高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，高、中劑量組間無顯著性差異(P＞0.05)。低劑量組、益血生組顯著高于對照組(P＜0.01)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊提高血液中EPO含量的作用優(yōu)于益血生。 6.大鼠腎組織病理結果比較：模型組大鼠腎小球囊腔及腎小管可見大量蛋白，腎小球血管硬化，纖維化，玻璃樣變，近曲小管上皮細胞內玻璃樣變；腎衰養(yǎng)真膠囊高、低劑量組可見腎小

12、球囊腔及腎小管大量蛋白，系模增生，纖維化，近曲小管上皮細胞內玻璃樣變，中劑量組腎小球囊腔及腎小管未見蛋白，可見系模增生。益血生組腎小球囊腔可見蛋白，系模增生，纖維化，彌漫性炎癥細胞浸潤。 結論：1.腎衰養(yǎng)真膠囊和益血生膠囊均可改善腎性貧血，腎衰養(yǎng)真膠囊療效優(yōu)于益血生膠囊，腎衰養(yǎng)真膠囊中劑量組療效為佳。腎衰養(yǎng)真膠囊能提高血清中EPO水平，貧血狀態(tài)改善，病理圖片顯示治療組與對照組相比，大鼠腎小球囊腔及腎小管蛋白顯著減少，腎小球血管硬

13、化、纖維化、玻璃樣變和近曲小管上皮細胞內玻璃樣變等損害明顯減輕，表明腎衰養(yǎng)真膠囊具有保護腎小管及管旁毛細血管內皮細胞及間質細胞，促進合成分泌EPO的作用。 2.腎衰養(yǎng)真膠囊能降低腎性貧血大鼠的紅細胞溶血的液體濃度，說明腎衰養(yǎng)真膠囊能夠增加紅細胞膜的穩(wěn)定性，降低紅細胞脆性，從而延長紅細胞的壽命。 3.腎衰養(yǎng)真膠囊能顯著提高大鼠紅細胞內GSH水平，療效優(yōu)于益血生膠囊。說明腎衰養(yǎng)真膠囊通過提高體內GSH濃度，增加抗氧化系統(tǒng)活性

14、，降低過氧化物毒性，保護紅細胞免受損傷，達到改善腎衰貧血的目的。 4.腎衰養(yǎng)真膠囊能顯著提高CRF貧血大鼠的血清鐵、轉鐵蛋白含量，說明腎衰養(yǎng)真膠囊可以促進鐵劑的吸收，提高鐵的利用。 第二章腎衰養(yǎng)真膠囊對腎衰貧血大鼠EPO基因表達的影響 目的：觀察腎衰貧血大鼠EPO基因表達的變化，探討腎衰養(yǎng)真膠囊對腎衰貧血大鼠EPO基因表達的影響。 方法：1.動物標本采集：實驗末解剖大鼠后，經4℃預冷焦碳酸二乙酯(DEPC

15、)水反復灌洗腎臟，修剪留取腎髓質200mg，RNAin液保存于-20℃冰箱中待測。 2.半定量RT-PCR檢測EPO基因的表達：取新鮮凍存腎組織200mg，按Trizol使用說明，提取總RNA，測定其純度和含量。根據文獻設計引物序列，EPO：引物1序列為5'-AGGCGCGGAGATGGGGGTGC-3′，引物2序列為5'-CCCCGGAGGAAGTTGGAGTAG-3'；β-肌動蛋白(β-actin)：引物1序列為5'-GTG

16、GGGCGCCCCAGGCACCA-3'，引物2序列為5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，并經聯(lián)網檢索geneBank，由上海博亞生物技術有限公司合成引物序列。取總RNA2μg，用一步法RT-PCR試劑盒獲取目的片段。RT-PCR逆轉錄擴增條件：逆轉錄30min，預變15min，然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。EPO擴增產物540bp，β-actin

17、擴增產物500bp。最后擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠(EB)染色，于紫外燈下拍照，將膠片上反應帶在GelDoc1000凝膠成像分析系統(tǒng)中掃描、打印并分析電泳帶的灰度，將EPO擴增產物和β-actin擴增產物灰度值進行比較。 結果：各組大鼠RT-PCR擴增產物經瓊脂糖電泳，Marker標記片斷為540bp和500bp，符合目的基因長度(圖2-1)。各組間灰度比較，高、中劑量組表達量明顯高于正常組(P＜0.01)，低