EWSR1及融合蛋白EWS-FLI1可能參與TRAF3負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路途徑.pdf

1、腫瘤嚴(yán)重危害人類健康,其發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜且未完全闡明,大量研究表明:多種信號(hào)途徑或轉(zhuǎn)錄因子的異常活化起重要作用。核轉(zhuǎn)錄因κB(nuclear factor B,NFκB)作為一類能和多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子部位κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì),在炎癥及多種腫瘤中是高度活化的。NFκB的異常活化不僅能夠激活多種癌基因的表達(dá),同時(shí)還可以下調(diào)抑癌基因的表達(dá),致使癌基因和抑癌基因之間的平衡被打破,從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此研究負(fù)

2、調(diào)控NFκB活化的機(jī)制或相關(guān)分子對(duì)揭示惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理及尋找腫瘤治療的新靶分子具有重要的意義。
　　腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(tumor necrosis factor receptor associated factors3,TRAF3)是NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控分子。它是IL-1/TLR家族相關(guān)的成員,可以和淋巴毒素β受體(lymphotoxin beta receptor,LTβR)、潛伏膜蛋白基因(la

3、tent membrane protein1,LMP1)等結(jié)合參與NFκB活化調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步研究TRAF3及其相關(guān)分子調(diào)控NFκB的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)室以TRAF3質(zhì)粒作為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與TRAF3相互作用的相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)尤文家族腫瘤相關(guān)蛋白(Ewing sarcoma breakpoint region1, EWSR1)可能與TRAF3相互作用。EWSR1是一種功能尚不明確的蛋白,它可以和11號(hào)染色體的FLI1(Friend l

4、eukemia virus integration1)易位形成融合蛋白EWS-FLI1,該融合蛋白在95％的尤文氏腫瘤上都有表達(dá),是導(dǎo)致尤文肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。隨后本實(shí)驗(yàn)室用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證出EWSR1和TRAF3確實(shí)存在相互作用;確定了EWSR1的相互作用區(qū)域在1-265AA和1-349AA,而在TRAF3中只有TRAF端介導(dǎo)了相互作用;并利用體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出大劑量的EWSR1可以促進(jìn)TRAF3的泛素化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們對(duì)EW

5、SR1及它的融合蛋白如何參與到NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中更加感興趣。
　　因此為了更深入的探討TRAF3和EWSR1及它的融合蛋白EWS-FLI1相互作用是如何參與到NFκB活化機(jī)制中并對(duì)腫瘤發(fā)展產(chǎn)生影響的,本研究中,用GST-pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)EWSR1和TRAF3在體外存在相互作用。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí):在NFκB經(jīng)典通路上,EWSR1能夠抑制TRAF3或TRAF6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性參與NFκB的活性調(diào)控,且它對(duì)

6、NFκB信號(hào)通路的影響可能不完全依賴和TRAF3的共同作用,而與其自身的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)域相關(guān);在NFκB非經(jīng)典通路中,EWSR1卻能促進(jìn)TRAF3或TRAF6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性,其中針對(duì)TRAF3的作用更關(guān)鍵,EWSR1對(duì)非經(jīng)典通路活性的調(diào)節(jié)主要依靠和TRAF3的結(jié)合。泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EWSR1能夠促進(jìn)TRAF3、TRAF6的泛素化。用小干擾RNA敲減EWSR1及EWS-FLI1的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)TRAF3介導(dǎo)的NFκB信號(hào)通路活性發(fā)生改變,提

7、示EWSR1和EWS-FLI1可能是NFκB通路調(diào)節(jié)過(guò)程中不可或缺的分子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EWSR1能夠抑制細(xì)胞因子TNFα、LPS對(duì)NFκB活性的激活,且對(duì)TNFα刺激的 NFκB轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用具有劑量依賴性。熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)EWSR1及TRAF3共定位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)EWSR1在正常肝組織、癌旁組織、肝癌組織中都廣泛表達(dá),目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的表達(dá)差異;而TRAF3主要定位在胞質(zhì),在肝癌組織的表達(dá)量明顯低于正常組織,提示它