NOK與EGFR在NSCLC表達(dá)相關(guān)性及高表達(dá)NOK細(xì)胞系SPC-A-1-NOK生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景:受體酪氨酸蛋白激酶RPTKs(Receptor protein tyrosine kinases)在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。2004年,Liu[4]報(bào)道了一種新的具有受體酪氨酸蛋白激酶RPTKs樣結(jié)構(gòu)的蛋白NOK(Novel Oncogene with Kinase-domain)。NOK可轉(zhuǎn)化NIH3T3和BaF3細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤的形成,誘發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)

2、處多個(gè)器官[5-6]。NOK在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[7-8]。NOK基因分子與FGF/PDGF受體超家族具有30％的同源性[9]。NOK可同時(shí)激活MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路[10]。因此,NOK介導(dǎo)的腫瘤形成可能是RPTKs誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)展的一個(gè)例子。但NOK對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制目前研究尚少,尤其是在非小細(xì)胞肺癌NSCLC(non-small cell lungcancer)中

3、分級(jí)分期的基因表達(dá)及與EGFR的關(guān)系仍不清楚。NOK蛋白缺少胞外配體結(jié)合區(qū),通過(guò)何種途徑激活及調(diào)節(jié)其下游信號(hào)通路尚不清楚。
　　目的:探討NOK與EGFR蛋白在肺腺、鱗癌組織和肺腺癌細(xì)胞系中是否存在共定位現(xiàn)象。明確NOK與EGFR基因在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)是否存在相關(guān)性。建立穩(wěn)定高表達(dá)NOK蛋白的SPC-A-1-NOK細(xì)胞系,觀察NOK對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,為進(jìn)一步研究NOK與EGFR相關(guān)性及其作用機(jī)

4、制、信號(hào)傳導(dǎo)通路提供平臺(tái)。
　　方法:1.激光共聚焦檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中NOK與EGFR蛋白是否存在共定位。RT-PCR檢測(cè)NOK與EGFR基因在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)。2.電穿孔法將pcDNA3.1-NOK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞,穩(wěn)定篩選建立高表達(dá)NOK肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1-NOK;通過(guò)RT-PCR、Real Time-PCR及Western blot方法檢測(cè)SPC-A-1-NOK細(xì)胞中NOK表達(dá)情況。激光共

5、聚焦檢測(cè)SPC-A-1-NOK細(xì)胞中NOK與EGFR蛋白是否存在共定位。3. MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞Matrigel試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:1.NSCLC組織經(jīng)NOK和EGFR雙免疫熒光染色,激光共聚焦成像,顯示NOK與EGFR蛋白在肺癌組織中表達(dá)存在共定位現(xiàn)象。運(yùn)用RT-PCR檢測(cè),顯示NOK與EGFR基因在肺腺

6、癌組織不同TNM分期中的表達(dá)存在相關(guān)性(spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)rs為0.720,P＜0.001)。2.通過(guò)RT-PCR、Real Time-PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)建立的SPC-A-1-NOK細(xì)胞系為穩(wěn)定高表達(dá)NOK的細(xì)胞系。SPC-A-1-NOK細(xì)胞經(jīng)激光共聚焦成像,顯示NOK與EGFR蛋白在SPC-A-1-NOK細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象。3.應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值能力,繪制增殖曲線顯示: SPC-A-1-N

7、OK細(xì)胞增殖曲線明顯較其余兩組高,且陡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,SPC-A-1-NOK細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞較兩對(duì)照組增多(28.00±1.42VS23.75±1.20、24.93±1.57,均P＜0.05);增殖指數(shù)PI升高(56.70±1.43VS46.89±1.19、46.47±1.32,均P＜0.05),處于Q2、Q4期的細(xì)胞減少(4.0±0.2VS8.4±0.5、7.9±0.4,均P＜0.05)。4.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示: S

8、PC-A-1-NOK細(xì)胞較兩對(duì)照組細(xì)胞遷移速度明顯加快。細(xì)胞Transwell試驗(yàn)顯示:轉(zhuǎn)染組SPC-A-1-NOK細(xì)胞同兩對(duì)照組細(xì)胞相比,穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加(68.6±7.3VS36.7±4.3、38.4±5.9,均P＜0.05)。細(xì)胞Matrigel侵襲試驗(yàn)顯示:轉(zhuǎn)染組SPC-A-1-NOK細(xì)胞同兩對(duì)照組細(xì)胞相比,穿過(guò)鋪有Matrigel的Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯增加(46.8±6.21VS17.5±3.28、16.23±

9、4.1,均P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.在肺腺、鱗癌組織和肺腺癌SPC-A-1-NOK細(xì)胞系中NOK與EGFR蛋白表達(dá)存在共定位現(xiàn)象。在肺腺癌組織不同TNM分期中,NOK與EGFR基因的表達(dá)存在相關(guān)性。提示NOK與EGFR有相互作用的可能。2.NOK高表達(dá)肺腺癌SPC-A-1-NOK細(xì)胞系建立成功,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)。3.NOK可促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞的增殖、抑制SPC-A-1細(xì)胞的凋亡,并提高SPC-A-1細(xì)胞的遷移和