達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的建立與蛋白表達(dá)特性研究.pdf

1、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的細(xì)胞工程中的主要領(lǐng)域之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及生物學(xué)的各個(gè)方面。特別是昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BaculovirusExpression Victor System，BEVS)被廣泛用于重組蛋白表達(dá)、工程疫苗和蛋白組學(xué)等領(lǐng)域，擁有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。本文以鱗翅目(Lepidoptera)鳳蝶科(Papilionidae)的達(dá)摩鳳蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼

2、蟲為試驗(yàn)材料，建立了4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系，并對其原代及傳代培養(yǎng)方法、基礎(chǔ)生物學(xué)特性、凍存與復(fù)蘇特性、病毒敏感性，以及對外源蛋白表達(dá)水平等方面進(jìn)行了較詳盡的研究。新昆蟲細(xì)胞系的建立不但為離體條件下進(jìn)行相關(guān)的昆蟲生理生化、桿狀病毒感染等研究提供實(shí)驗(yàn)材料，也為昆蟲細(xì)胞系的建立研究、昆蟲細(xì)胞工程研究奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　1、達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的建立
　　使用改良的Grace培養(yǎng)基并輔以20％胎牛血清對達(dá)摩

3、鳳蝶新孵幼蟲組織進(jìn)行體外培養(yǎng)。經(jīng)過2年多的培養(yǎng)，最終有4瓶培養(yǎng)物傳代超過50次且生物學(xué)特性穩(wěn)定、生長一直良好，成為可穩(wěn)定傳代的達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系，分別命名為RIRI-PaDe-1、RIRI-PaDe-2、RIRI-PaDe-3，以及RIRI-PaDe-4。
　　2、達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的基礎(chǔ)生物學(xué)特性
　　(1)細(xì)胞系來源的分子鑒定:通過比對4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系和蟲卵的細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因(COⅠ)序列，結(jié)果顯示來

4、源于4株細(xì)胞系和蟲卵的COⅠ序列相似度為100％，證明4個(gè)新建細(xì)胞系來源于達(dá)摩鳳蝶組織。
　　(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系均為貼壁生長型細(xì)胞，培養(yǎng)初期細(xì)胞種類多樣，進(jìn)入穩(wěn)定傳代期后，各細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)組成出現(xiàn)一定差異。
　　RIRI-PaDe-1細(xì)胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形，其中圓形細(xì)胞占61.73±1.33％，直徑從7.06μm至35.112μm不等，懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.79±0.27μm。<

5、br>　　RIRI-PaDe-2細(xì)胞形態(tài)主要為圓形，直徑從7.14μm至27.66μm不等，平均直徑為13.920-±0.025μm，懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.87±0.27μm。
　　RIRI-PaDe-3細(xì)胞形態(tài)主要為類似表皮細(xì)胞和纖維狀細(xì)胞，懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.66±0.56μm。
　　RIRI-PaDe-4細(xì)胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形，其中圓形細(xì)胞占58.35±4.22％，直徑平均為13.8

6、13±0.421μm，懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.71±0.47μm。
　　(3)細(xì)胞增殖動力學(xué)特性:通過試驗(yàn)繪制了4個(gè)細(xì)胞系的生長曲線，計(jì)算各個(gè)細(xì)胞系的群體倍增時(shí)間分別為:RIRI-PaDe-1是69.77h，RIRI-PaDe-2是67.42h，RIRI-PaDe-3是81.48h，RIRI-PaDe-4是65.43h，其中，RIRI-PaDe-4細(xì)胞增殖一倍所需時(shí)間最短，RIRI-PaDe-3細(xì)胞系的倍增時(shí)間最長。

7、r>　　(4)核型分析:經(jīng)過試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，制片時(shí)使用的KCl低滲溶液最適濃度為0.60％。在1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，4個(gè)達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的染色體呈點(diǎn)狀聚集于核區(qū)，雖然數(shù)量眾多，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果呈正態(tài)分布。細(xì)胞系RIRI-PaDe-1（61代）的染色體數(shù)目分布區(qū)間為36～90，平均為63條;RIRI-PaDe-2（60代）的染色體數(shù)目分布區(qū)間為49～97，平均為73條;RIRI-PaDe-3（52代）的染色體數(shù)目分布區(qū)間為46～9

8、0，平均為68條;RIRI-PaDe-4（52代）的染色體數(shù)目分布區(qū)間為45～91，平均為68條。
　　(5)凍存與復(fù)蘇特性:通過對4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系進(jìn)行長期液氮深低溫冷凍保存，分析凍存時(shí)間長短對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示4個(gè)細(xì)胞系經(jīng)過長期凍后活力均呈下降趨勢。但復(fù)蘇培養(yǎng)后能在短期(10d)內(nèi)恢復(fù)活力，且生長特性不變，說明使用常規(guī)凍存操作方法能夠?qū)崿F(xiàn)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系在液氮中的長期保存與復(fù)蘇。
　　3、達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對6種昆蟲桿狀

9、病毒的敏感性
　　使用6種常見鱗翅目昆蟲桿狀病毒（苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV、家蠶核型多角體病毒BmNPV、春尺蠖核型多角體病毒AciNPV、美國白蛾核型多角體病毒HycuNPV、舞毒蛾核型多角體病毒LdNPV，以及柞蠶核型多角體病毒AnpeNPV）對4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系進(jìn)行侵染測試，觀察4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對病毒的反應(yīng)，確定能夠侵染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的病毒。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcMNPV能感染4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系;AciNP

10、V和HycuNPV均可感染RIRI-PaDe-1、RIRI-PaDe-2、RIRI-PaDe-4，不能感染RIRI-PaDe-3;其余3株病毒均不能感染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系。表明，4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系都對AcMNPV敏感， RIRI-PaDe-1、 RIRI-PaDe-2，以及RIRI-PaDe-4細(xì)胞系對AciNPV和HycuNPV敏感;4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對BmNPV、LdNPV，以及AnpeNPV均不敏感。
　　4、對3種報(bào)告基因表達(dá)

11、水平的研究
　　為了研究4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對重組外源基因的表達(dá)特性，本論文利用Bac-to-Bac(R)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了3株攜帶不同報(bào)告基因的重組桿狀病毒，分別為重組綠色熒光蛋白桿狀病毒AcMNPV-GFP、重組β-半乳糖苷酶桿狀病毒AcMNPV-LacZ，以及重組分泌型堿性磷酸酶桿狀病毒AcMNPV-SEAP。通過感染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系和作為對照的Sf9和HighFive細(xì)胞系，檢測和比較重組蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平。

12、>　　(1)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對AcMNPV-GFP敏感性:使用有限稀釋法，測定達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系、Sf9，以及HighFive對AcMNPV-GFP的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Median Tissue CultureInfectious Dose，TCID50)，獲得結(jié)果為:RIRI-PaDe-2和RIRI-PaDe-4表達(dá)的綠色熒光蛋白量及其微弱，鏡檢無法觀測到;HighFive的TCID50最小(10-6.88)，說明對AcMNPV-GFP

13、最敏感，其次是RIRI-PaDe-1（TCID50=10-655），之后為Sf9(TCID50=10-65)，對AcMNPV-GFP敏感度最低的是RIRI-PaDe-3（TCID50=10-5.45）。
　　(2)重組綠色熒光蛋白在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:SD對重組綠色熒光蛋白的表達(dá)量最高。雖然細(xì)胞系RIRI-PaDe-1對AcMNP-GFP敏感性比Sf9高，但重組綠色熒光蛋白的表達(dá)水平僅為Sf9的1/10，RIRI-PaDe

14、-3的表達(dá)水平為Sf9的1/18，RIRI-PaDe-2和RIRI-PaDe-4的表達(dá)水平為Sf9的1/27，HighFive表達(dá)重組綠色熒光蛋白的水平為Sf9的一半。
　　(3)重組β-半乳糖苷酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:重組β-半乳糖苷酶在4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平均很低。接種AcMNPV-LacZ病毒48h后Sf9和HighFive便開始顯著表達(dá)重組β-半乳糖苷酶，此時(shí)4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中重組β-半乳糖苷酶活性非常低

15、。96h后RIRI-PaDe-3細(xì)胞中檢測到重組β-半乳糖苷酶活性升高，但僅為Sf9中β-半乳糖苷酶活性的1/11。216h后重組β-半乳糖苷酶在6個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)量達(dá)到最大，HighFive最高，其次為Sf9，RIRI-PaDe-3僅為HighFive的1/8，RIRI-PaDe-4表達(dá)量排第4，約為HighFive表達(dá)水平的1/18，RIRI-PaDe-2約為HighFive的1/24，RIRI-PaDe-1表達(dá)水平最低。
　　

16、(4)重組分析型堿性磷酸酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:重組SEAP在4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平與Sf9和HighFive的相當(dāng)甚至更高。接種AcMNPV-SEAP病毒48h后6個(gè)細(xì)胞系均顯著表達(dá)重組SEAP。144h時(shí)RIRI-PaDe-1和RIRI-PaDe-2的表達(dá)量達(dá)增加最快。169h后各細(xì)胞系均達(dá)到表達(dá)最高峰，相互之間表達(dá)量相差不大。216h后各除RIRI-PaDe-3外，其他5個(gè)細(xì)胞系表達(dá)重組SEAP的水平均開始下降。到

17、240h時(shí)，RIRI-PaDe-3仍保持較高的重組SEAP表達(dá)水平。結(jié)果表明，4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對重組SEAP的表達(dá)水平與Sf9和HighFive相當(dāng)，其中RIRI-PaDe-3細(xì)胞系對重組SEAP的表達(dá)水平顯著高于Sf9和HighFive，有開發(fā)和利用其作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)宿主細(xì)胞系的潛力。
　　綜上所述，本文以達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲為試驗(yàn)材料建立了4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系，其基礎(chǔ)生物學(xué)特性、病毒敏感性，以及對外源蛋白表達(dá)水平等方面均有差異