穩(wěn)定表達(dá)EGFR細(xì)胞系的建立及其抗EGFR單鏈抗體的篩選與鑒定.pdf

1、第一部分 穩(wěn)定表達(dá)EGFR-GFP融合蛋白細(xì)胞系的建立 目的建立膜表面穩(wěn)定表達(dá)EGFR-GFP融合蛋白的細(xì)胞系，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法采用CaCl2法將pEGFR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切鑒定后提取質(zhì)粒經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞；以EGFP作為熒光報(bào)告分子，克隆化培養(yǎng)以獲取單克隆陽(yáng)性細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡術(shù)、WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR-GFP融合蛋白的表達(dá)；反復(fù)凍存、復(fù)蘇

2、、傳代鑒定細(xì)胞表達(dá)EGFR-GFP融合蛋白的穩(wěn)定性。 結(jié)果①轉(zhuǎn)染后，經(jīng)G418篩選14天，克隆化培養(yǎng)，共獲得2株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞，分別命名為CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2②經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞GFP、PE雙標(biāo)記陽(yáng)性率達(dá)92％以上，說(shuō)明EGFR-GFP融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，CHO-EGFR-GFP2細(xì)胞GFP檢測(cè)陽(yáng)性率較高，但PE標(biāo)記陽(yáng)性率較低，提示融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)

3、胞內(nèi)；⑧倒置相差熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)CHO-EGFR-EGFP1主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜綠色熒光，能與PE標(biāo)記的anti-human-EGFR結(jié)合，CHO-EGFR-EGFP2細(xì)胞主要呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光，不與PE標(biāo)記的anti-human-EGFR結(jié)合，與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致；④Westernblot分析CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞裂解液可見(jiàn)分子量約166kDa條帶；⑤CHO-EGFR-EGFP1細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍存、復(fù)蘇，證明EGFR-GFP融合

4、蛋白能穩(wěn)定表達(dá)，表明成功建立穩(wěn)定表達(dá)EGFR-GFP融合蛋白的細(xì)胞系，為研究EGFR與其配體間相互作用以及篩選靶向EGFR的單鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 EGF對(duì)CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，EGFR與其配體EGF相互作用往往促進(jìn)其增殖，但對(duì)于某些細(xì)胞，EGF且相反地抑制其增殖。本部分研究擬以所建立的膜表面表達(dá)全長(zhǎng)EGFR與GFP融合蛋白的細(xì)胞系CHO-EGFR-GFP

5、1為模型，進(jìn)一步研究EGF與EGFR之間相互作用。 方法通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)觀察不同濃度EGF刺激48h后細(xì)胞增殖情況；PI染色一步法流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度EGF刺激48h和100ng/mlEGF刺激不同時(shí)間細(xì)胞周期改變以及細(xì)胞凋亡情況，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GFP平均熒光強(qiáng)度、Westernblot檢測(cè)及倒置熒光顯微鏡觀

6、察判定EGFR表達(dá)水平的變化。 結(jié)果以建立的膜表面表達(dá)全長(zhǎng)EGFR與GFP融合蛋白的細(xì)胞系CHO-EGFR-GFP1為細(xì)胞模型，研究EGF與EGFR之間的相互作用。研究結(jié)果表明：①在不加入EGF的培養(yǎng)體系中，CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞生長(zhǎng)特性無(wú)顯著差異，在保證培養(yǎng)條件、接種細(xì)胞數(shù)、觀察時(shí)間基本一致的情況下，各細(xì)胞增殖速度接近，說(shuō)明表達(dá)的融合蛋白對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性；②在培養(yǎng)體

7、系中，加入低濃度的EGF可促進(jìn)CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞增殖，而在高濃度EGF培養(yǎng)體系中則引起CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞失去粘附、細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞增殖；③EGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響與EGFR表達(dá)水平密切相關(guān)，高濃度EGF以一種劑量依賴性的方式同時(shí)上調(diào)EGFR的表達(dá)和引起細(xì)胞凋亡；④EGF刺激對(duì)CHO-K1及CHO-EGFR-GFP2細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯作用。 第三部分 EGFR特異性內(nèi)吞性單鏈抗體的篩

8、選與鑒定 目的利用抗體將治療分子(毒素、治療基因)直接運(yùn)送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用是一種重要的腫瘤靶向治療策略。本研究擬從大型人源抗體庫(kù)Griffin1中直接篩選出靶向EGFR并能夠觸發(fā)其內(nèi)吞的單鏈抗體，為研究靶向EGFR的抗腫瘤治療藥物奠定基礎(chǔ)。 方法以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞分別作為陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，采用負(fù)篩選的方法，洗去與細(xì)胞表面結(jié)合的噬菌體，裂解細(xì)胞獲取內(nèi)吞性的噬菌體用于下一輪

9、篩選；通過(guò)比較每輪投入及洗脫出噬菌體的效價(jià)比以及細(xì)胞ELISA檢測(cè)多克隆p-scFv與陽(yáng)性、陰性細(xì)胞結(jié)合情況對(duì)篩選過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)；采用菌落PCR挑選含有全長(zhǎng)scFv片斷的菌落，進(jìn)一步用FCM檢測(cè)單克隆p-scFv與天然表達(dá)EGFR細(xì)胞及EGFR陰性細(xì)胞結(jié)合情況；挑選EGFR特異性單克隆p-scFv采用DNA測(cè)序法確定克隆多樣性；原核表達(dá)EGFR特異性s-scFv采用FCM檢測(cè)其與天然表達(dá)EGFR細(xì)胞及EGFR陰性細(xì)胞結(jié)合百分率，采用Wes

10、ternblot檢測(cè)其與EGFR陽(yáng)性細(xì)胞及陰性細(xì)胞裂解液結(jié)合的差異，倒置熒光顯微鏡觀察s-scFv是否被內(nèi)吞入EGFR陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)果經(jīng)過(guò)5輪篩選，細(xì)胞裂解液中洗脫出噬菌體效價(jià)有500倍以上提高，而細(xì)胞表面結(jié)合噬菌體效價(jià)僅有15倍增長(zhǎng)，說(shuō)明內(nèi)吞性p-scFv得到富集；細(xì)胞ELISA結(jié)果顯示多克隆p-scFv與CHO-EGFR-GFP1細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞均有明顯結(jié)合，但與前者結(jié)合高于后者，說(shuō)明所獲多克隆p-scFv大多數(shù)針對(duì)兩

11、種細(xì)胞表面共同抗原，但有部分特異性結(jié)合EGFR；菌落PCR顯示約45％克隆中含有完整的1kbscFv片斷；共挑取300個(gè)菌落，經(jīng)菌落PCR、細(xì)胞ELISA、FCM檢測(cè)，共得到4株EGFR特異性scFv，DNA測(cè)序結(jié)果顯示4株DNA序列僅一株有個(gè)別堿基不同，但均能翻譯成同樣的氨基酸系列，因此將其統(tǒng)一命名為F4-scFv，F(xiàn)4-scFv可與天然表達(dá)EGFR的細(xì)胞特異性結(jié)合并能觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，但不與EGFR陰性細(xì)胞結(jié)合；Western

12、blot檢測(cè)F4-scFv可識(shí)別EGFR特異性條帶。F4-scFv可被用作載體運(yùn)送治療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而且由于其人源性，對(duì)人將無(wú)免疫原性。在篩選和鑒定過(guò)程中采用表達(dá)GFP標(biāo)記的受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞，不用表達(dá)、純化受體蛋白用于篩選和檢測(cè)，可保證所篩選的抗體能與天然受體結(jié)合，加快了獲取靶向抗體的進(jìn)程。 結(jié)論成功建立膜表面穩(wěn)定表達(dá)EGFR-GFP的細(xì)胞系CHO-EGFR-GFP1；首次在同一種因不同濃度EGF刺激而表達(dá)不同水平

13、EGFR的細(xì)胞中觀察到EGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響與EGFR表達(dá)水平的關(guān)系。高濃度EGF刺激引起腫瘤細(xì)胞失去粘附可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞容易脫落，發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一；進(jìn)一步以CHO-EGFR-GFP1為陽(yáng)性細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞為陰性細(xì)胞，采用負(fù)篩選方法，從大型人源抗體庫(kù)中篩選得到EGFR特異性能夠觸發(fā)受體內(nèi)吞的單鏈抗體F4-scFv，F(xiàn)4-scFv可用于運(yùn)載治療性物質(zhì)進(jìn)入高表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞，為進(jìn)一步研究靶向EGFR的抗腫瘤治療藥物奠定