超聲微泡造影劑介導(dǎo)p53基因轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞的基礎(chǔ)研究.pdf

1、宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌而居第二位。其治療方式主要包括：手術(shù)治療、放療、化療、免疫治療、熱療等?；蛑委熓悄壳把芯康臒狳c(diǎn),但基因載體問(wèn)題是其發(fā)展的瓶頸。超聲微泡造影劑作為一種新型的基因轉(zhuǎn)染載體可實(shí)現(xiàn)安全、高效及靶向性的基因轉(zhuǎn)染。本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究超聲微泡造影劑攜帶野生型p53基因轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率并探討wtp53基因?qū)eLa細(xì)胞的作用效果。本研究分三部分：
　　 第一部分：

2、　　 目的：探討一定超聲強(qiáng)度作用下,微泡濃度對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響,以期得到最優(yōu)的超聲微泡參數(shù)組合,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：將HeLa細(xì)胞分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別加入1％、5％、10％、20％的微泡濃度,每種微泡濃度分別給予0.5W/cm2,30s和0.75W/cm2,30s兩種不同強(qiáng)度的超聲輻照,MTT法檢測(cè)不同超聲微泡濃度對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
　　 結(jié)果：超聲輻照0.5 W/cm2,30s時(shí),

3、1％、5％、10％、20％的微泡濃度所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率分別為(94.25±0.76)％、(86.78±0.87)％、(82.41±1.81)％、(62.72±1.71)％:超聲輻照0.75 W/cm2,30s時(shí),1％、5％、10％、20％的微泡濃度所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率分別為(92.59±1.32)％、(84.00±0.69)％、(75.74±0.44)％、(59.35±0.58)％。
　　 結(jié)論：超聲微泡聯(lián)合作用對(duì)HeLa細(xì)胞的增

4、殖具有抑制作用,且隨著微泡濃度的增大,超聲強(qiáng)度的增加,對(duì)細(xì)胞的殺傷力明顯增強(qiáng)。為了提高基因轉(zhuǎn)染效率,在不明顯影響細(xì)胞生長(zhǎng)活性的前提下,我們選擇0.5 W/cm2,30s的超聲輻照,10％的微泡濃度作為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的條件。
　　 第二部分：
　　 目的：以第一部分所篩選出的超聲微泡優(yōu)化參數(shù)為實(shí)驗(yàn)條件,即O.5W/cm2,30s的超聲輻照,10％微泡濃度,對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行p53基因轉(zhuǎn)染,并與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法進(jìn)

5、行轉(zhuǎn)染效率的比較。
　　 方法：將HeLa細(xì)胞分為5組,以不同方法轉(zhuǎn)染p53基因:A.質(zhì)粒組；B.質(zhì)粒+超聲組；C.質(zhì)粒+超聲+微泡組；D.質(zhì)粒+脂質(zhì)體組；E.空白對(duì)照組。培養(yǎng)24-48h后,用熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)的方式比較各組的轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR對(duì)p53 mRNA表達(dá)進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果：⑴熒光顯微鏡下C組和D組均見(jiàn)較多明亮的綠色熒光細(xì)胞,兩組轉(zhuǎn)染率相比,C組高于D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B組

6、僅見(jiàn)極少量熒光細(xì)胞,A組和E組幾乎見(jiàn)不到熒光細(xì)胞。⑵RT-PCR顯示C組和D組可見(jiàn)明亮的特異性p53電泳條帶,C組的p53/β-actin光密度比值較D組大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余各組未檢測(cè)到相應(yīng)電泳條帶。
　　 結(jié)論：適當(dāng)濃度的微泡造影劑聯(lián)合優(yōu)化的超聲輻照可有效地介導(dǎo)外源性p53轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞,其轉(zhuǎn)染效率高于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。超聲微泡作為一種新型的轉(zhuǎn)染載體,可實(shí)現(xiàn)較為高效的基因轉(zhuǎn)染。
　　

7、第三部分：
　　 目的：探討采用不同方式轉(zhuǎn)染wtp53基因后,對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
　　 方法：將HeLa細(xì)胞分為5組,以不同方法進(jìn)行wtp53基因轉(zhuǎn)染:A.質(zhì)粒組；B.質(zhì)粒+超聲組；C.質(zhì)粒+超聲+微泡組；D.質(zhì)粒+脂質(zhì)體組；E.空白對(duì)照組。培養(yǎng)24-48h后,MTT法檢測(cè)HeLa細(xì)胞的增殖抑制情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：⑴MTT檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h,各組細(xì)胞的增殖

8、均受到抑制,其中質(zhì)粒+超聲+微泡組細(xì)胞受抑制程度最明顯,且隨時(shí)間延長(zhǎng),抑制率逐漸增大。⑵流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,與空白對(duì)照組相比,C組和D組進(jìn)入G1期的細(xì)胞明顯增多,G2期的細(xì)胞明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。C組與D組兩者相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染wtp53對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)具有較明顯的抑制作用,超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染所引起的細(xì)胞增殖抑制程度最明顯；質(zhì)粒+超聲+微泡、質(zhì)粒+脂質(zhì)體兩