P38MAPK在胃癌細(xì)胞株中的作用及與COX-2關(guān)系的研究.pdf

1、目的：胃癌是嚴(yán)重威脅我國人民健康的疾病，在我國其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。臨床流行病學(xué)調(diào)查、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明：非甾體抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs)能降低消化道腫瘤的發(fā)病率。其抑癌機(jī)制與COX-2、P38MAPK密切相關(guān)。 環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素(prostaglandin，PG)合成過程中的主要限速酶，在人類至少有兩種同工酶：COX-

2、1和COX-2。研究發(fā)現(xiàn)COX-2與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在胃腸道腫瘤中表達(dá)增高。 絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)級(jí)聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)MAPK包括4個(gè)亞族：應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activatedproteinkinase，SAPK)又稱c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-term

3、inalkinase，JNK)；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extrocellular-signalregulatedkinase2，ERK-2)；大絲裂原活化蛋白激酶(bigMAPkinase1，BMK1)和P38MAPK。P38MAPK是近年來信號(hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，它除了在炎癥介導(dǎo)、應(yīng)激等多種細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用外，還與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)和活性的變化可有效調(diào)節(jié)關(guān)鍵的信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞凋亡。 NS

4、AIDs是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛消炎藥，包括兩類：COX-2選擇性抑制劑(如NS398)和非選擇性抑制劑(如消炎痛)。NSAIDs能降低消化道腫瘤的發(fā)病率。其抑癌機(jī)制目前尚不十分清楚?？赡芡ㄟ^抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、免疫監(jiān)視、抑制COX活性等抑制腫瘤的發(fā)生，其中抑制COX-2活性是主要途徑。NSAIDs抑癌的機(jī)制不僅僅是通過抑制COX-2一條途徑，P38MAPK參與了COX-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs還能通過激活P38MAPK途徑

5、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)采用Westernblotting法檢測(cè)COX-2和P38MAPK抑制劑作用于胃癌細(xì)胞株后COX-2、P38MAPK表達(dá)量的變化，探討NSAIDs的抑癌機(jī)制，P38MAPK的作用及與COX-2的關(guān)系。 方法：用含10％胎牛血清，105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5％CO2條件下體外常規(guī)培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON組)、NS398組(N

6、S組)、SB203580組(SB組)、SB203580和NS398共同作用組(SBNS組)以及溶劑對(duì)照組。CON組：不加任何處理措施；NS組：70μmol/L的NS-398(根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果)作用48h；SB組：5μmol/L的SB203580[28]作用48h；SBNS組：先用5μmol/L的SB203580作用于SGC7901細(xì)胞30min,然后再用70μmol/L的NS-398作用48h。首先用MTT法檢測(cè)NS-398對(duì)SGC7

7、901細(xì)胞增殖的抑制作用；去對(duì)數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞按試驗(yàn)分組加入藥物作用48h，離心收集細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞定量檢測(cè)技術(shù)(FCM)檢測(cè)SGC7901細(xì)胞凋亡和增殖情況；應(yīng)用FCM和蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)SGC7901細(xì)胞中COX-2、P38MAPK蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果1MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果顯示NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長有抑制作用，高濃度組的抑制作用隨著時(shí)間的積累要大于低濃度組，溶劑對(duì)照

8、組細(xì)胞未見明顯變化，細(xì)胞增殖與空白對(duì)照組相似。NS-398IC50濃度為70μmol/L。 2FCM檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)各組分別用藥物作用于細(xì)胞株48小時(shí)，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況并作細(xì)胞周期分析。各組藥物作用于SGC-7901細(xì)胞均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖水平下降，且凋亡率與對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)；SBNS組細(xì)胞凋亡率高于NS組和SB組(P＞0.05)；對(duì)細(xì)胞周期的影響，各組藥物均可使兩

9、種細(xì)胞的S期比例降低(P＜0.05或P＜0.01)，SBNS組可使細(xì)胞G0/G1期比例增加(P＜0.01)，但對(duì)G2/M期無明顯影響。 3WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞中COX-2和P-P38MAPK蛋白表達(dá)情況 β-actin蛋白分子量為42kD，COX-2蛋白分子量為72kD，P-P38MAPK蛋白分子量為38kD，Western雜交后在相應(yīng)位置出現(xiàn)陽性條帶。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)雜交條帶進(jìn)行半定量分析，蛋白含量以積

10、分光密度值(IOD)表示。以βactin蛋白作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，以相對(duì)積分光密度比較各組蛋白表達(dá)的高低。 COX-2蛋白表達(dá)情況：COX-2蛋白表達(dá)量SB組、NS組和SBNS組明顯低于CON組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。COX-2蛋白表達(dá)量SBNS組明顯低于NS組和SB組(P＜0.01或P＜0.05)。可見NS398和P38MAPK特異性抑制劑SB203580均可降低COX-2蛋白表達(dá)水平。P-P38MAPK蛋

11、白表達(dá)情況：P-P38MAPK蛋白表達(dá)量SB組明顯低于CON組(P＜0.01)；而NS組和SBNS組明顯高于CON組(P＜0.01或P＜0.05)，SBNS組P-P38MAPK蛋白表達(dá)量介于NS組和SB組之間(P＞0.05)。 結(jié)論1在胃癌細(xì)胞株SGC7901中，P38MAPK是COX-2的上游激酶，P38可上調(diào)COX-2的表達(dá)，COX-2可能對(duì)P38有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。 2P38活化后在胃癌細(xì)胞株SGC7901中的最終效